间充质干细胞对急性肾损伤的保护机制

任贵生 综述 黄湘华 审校



·肾脏病临床·

间充质干细胞对急性肾损伤的保护机制

任贵生 综述 黄湘华 审校

急性肾损伤已经成为一个公共健康问题。尽管支持治疗已经取得巨大进展，但是急性肾损伤的发病率和死亡率仍然很高。为提高肾脏有限的再生能力，已有研究利用不同来源的间充质干细胞治疗急性肾损伤。这些研究均表明间充质干细胞具有向受损组织细胞定向分化的能力，同时还具有旁分泌功能，其在修复急性损伤器官中有广阔的应用前景。本文将探讨间充质干细胞促进肾脏组织再生的潜在机制及临床研究进展。

间充质干细胞 急性肾损伤 机制

急性肾损伤(AKI)是由急性肾小管坏死或急性间质性肾炎等原因导致的肾功能在短时间内急剧下降，可由肾毒性物质或肾脏缺血等引起。AKI可导致高血钾、代谢性酸中毒，严重时可危及生命。随着透析技术的进步，极大改善了AKI患者的预后，但是目前仍然缺乏可有效减轻肾脏损伤和促进肾脏修复的治疗手段。在过去的数十年，有关干细胞的研究取得了长足的进步。现阶段，造血干细胞移植治疗血液系统疾病已在临床广泛开展，并取得了令人满意的效果。此外，不同种类的干细胞用来治疗其他疾病的研究也已经取得了大量的实验数据，包括间充质干细胞(MSC)用于治疗AKI。MSC治疗AKI的研究已经开展了很长的时间，主要基于MSC对实验动物的研究。在MSC治疗AKI进入临床实践之前，仍存在许多问题需要解决，包括最佳的细胞类型、细胞来源、输注时机与途径的选择及所需要的细胞数量等。虽然从动物模型中得到的结果可能并不完全适用于临床，但是对于干细胞治疗而言，基础研究非常重要。本文就干细胞治疗对于损伤肾脏保护作用的潜在机制及其在AKI中可能的临床应用前景作一简述。

MSC的特性

MSC是骨髓造血龛的重要组成部分，约占骨髓细胞的0.01%。MSC是一种异质性多能干细胞群体，可分化为中胚层来源的细胞，例如脂肪细胞，软骨细胞及骨细胞。然而，无论是在体外还是在体内，MSC能否转分化为外胚层和内胚层来源的组织特异性细胞仍存在争议[1]。MSC最初是在骨髓细胞中得以鉴别，但也存在于其他组织中，包括外周血、结缔组织、脂肪组织、骨骼肌、脐带血及羊水。尽管组织来源的不同会导致细胞功能的差异(表1)[2]，但是培养的人类MSC表达不同水平的CD105、CD73、CD44、CD90、CD271、CD166及Stro-1，而不表达CD14、CD11b、CD45等造血细胞表面标记[3]。通过细胞间的联系及在局部释放特殊的细胞因子、趋化因子及生长因子，MSC调节造血干细胞的自我更新、成熟及向血管组分募集。目前，国际细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy，ISCT)提出了MSC的最基本定义：(1)在标准培养条件下呈贴壁生长；(2)必须表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD32、CD14或CD11b、CD79α或CD19及HLA-DR表面标记；(3)在体外可分化为成骨细胞、脂肪细胞或成软骨细胞[4]。

表1 不同来源间充质干细胞的差异

最近的研究表明，包括肾脏在内的多个器官中存在同时表达外周细胞标记和MSC标记的外周血管细胞[5]，这提示MSC在维持血管的稳定性中发挥作用。MSC具有强大的免疫调节活性，因此其在器官移植中有巨大的临床应用潜力[6]。事实上，无论是在体外还是在体内条件下，通过细胞间的相互作用、释放可溶性因子，MSC强烈抑制T细胞增殖。对B细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和固有免疫细胞，MSC也表现出相似的抑制效果[6]。

MSC对AKI动物模型的影响

MSC的肾脏保护作用主要有抗炎、促血管生成、动员内源性祖细胞、抗凋亡、抗纤维化、抗氧化及促进细胞重编程等[7]。研究表明，在生理环境下，骨髓来源的干细胞可分化为肾脏的多种固有组分，包括肾小管上皮细胞、足细胞、系膜细胞及毛细血管内皮细胞[8,9]。基于MSC的再生能力、在骨髓龛中的生物学特性及在许多疾病中向受损组织的趋向运动，已经通过AKI动物模型来探讨MSC的治疗效应[10]。有研究报道，输入鼠源性骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSC)可减轻顺铂诱导的AKI大鼠的肾功能损害和肾小管损伤[11]。BM-MSC显著提高了肾小管细胞中Ki-67阳性细胞的数量，提示肾脏细胞增生是干细胞促进肾脏修复的关键步骤[11]。将从人类骨髓中获得的MSC应用于顺铂诱导AKI的非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID,no obesity diabetes/severe combined immunodeficient)小鼠中，结果提示在不引起不良反应的前提下，5×105细胞/鼠是最为有效的注射剂量[12]。人源性BM-MSC抵达了受损的肾组织，虽然数量有限，但还是发挥了保护肾功能和肾小管完整性的作用，进而延长了小鼠的存活时间。除了维持微血管的完整性、改善肾组织的氧供外，人源性BM-MSC还可以促进近端肾小管上皮细胞增生，抑制其凋亡[12]。

为了寻找实用性更强的用以修复肾损伤的MSC，对人类脂肪组织(hAD)来源的MSC进行了深入研究。实验表明hAD-MSC的注入并未改善罹患AKI的NOD/SCID小鼠的肾功能[13]，反而增加了肾小管上皮细胞刷状缘脱落及肾小管细胞的核碎裂和坏死。此外，对人类胚胎组织来源的干细胞也进行了探索[14]，其中包括人类脐带血间充质干细胞(hCB-MSC)及人类羊水间充质干细胞(hAF-MSC)。hCB-MSC与BM-MSC具有共同的形态特征、免疫表型和多向潜能，但hCB-MSC与基质重建及血管新生相关的基因表达水平更高[15]。hCB-MSC注入以减轻NOD/SCID AKI小鼠肾功能损伤和肾小管损伤。与hBM-MSC相比，hCB-MSC显著地延长了实验动物的生存时间[16]。hAF-MSC是一种同时具备胚胎干细胞和成人干细胞特征的干细胞，具有很好的可塑性和扩展性[17]。在顺铂诱导NOD/SCID AKI小鼠中注入hAF-MSC以改善肾功能并减轻肾小管损伤，其延长实验动物生存时间的效果与hBM-MSC相当。上述研究结果表明，hBM-MSC、hCB-MSC和hAF-MSC均有成功应用于人类AKI的前景，其中尤以hCB-MSC为佳。

MSC旁分泌在治疗AKI中的作用

许多研究试图更好地解释干细胞治疗促进受损肾组织再生过程中可能的机制。小鼠来源的BM-MSC以短暂地进入受损的肾组织，在缺血再灌注损伤模型中，通过产生抗凋亡因子、促有丝分裂因子及血管趋化因子，发挥保护肾功能和减轻肾小管损伤的作用[18]。在动物模型中，BM-MSC下调了肾脏中白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)的表达，而上调了抗炎细胞因子[包括IL-10、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子α(TGF-α)在内的生长因子及B淋巴细胞瘤2基因(Bcl-2)]的表达[18]。在顺铂诱导NOD/SCID AKI大鼠中重复注射BM-MSC的培养基可局限肾脏损伤，减少细胞凋亡并延长动物生存时间，有力地支持MSC通过局部的旁分泌发挥肾脏保护作用[19]。体外，通过与顺铂损伤的近端肾小管上皮细胞一起培养并进行物理分离，BM-MSC表现出了促有丝分裂和抗凋亡的作用，这也提示可溶性因子在MSC肾脏保护中发挥作用[11]。在顺铂诱导的AKI动物模型中，胰岛素样生长因子1(IGF-1)敲除削弱了BM-MSC对于大鼠肾功能和肾小管损伤的保护作用[11]。相似地，在缺血再灌注损伤模型中，将血管内皮生长因子(VEGF)沉默可减弱BM-MSC促进肾功能恢复及延长动物生存时间的效果[20]。

在MSC的肾脏保护中，进入受损组织的MSC数量并不多，提示MSC的保护作用可能与释放可溶性因子有关。MSC来源的微囊泡和外质体被认为可介导细胞间交流，通过mRNA及microRNA介导与细胞活动相关的功能蛋白和遗传物质的转运[21]。活化细胞表面释放的微囊泡相对较大(直径100 nm～1 mm)，而作为小的膜片段，外质体的直径为30～90 nm[21]。最近有研究比较了少量的人类BM-MSC与同等量的BM-MSC所产生的微囊泡在甘油诱导AKI的大鼠中的效果。结果表明，两者对受损的肾组织起相似的保护作用[22]。顺铂损伤的近端肾小管细胞的修复与BM-MSC释放的IGF-1的营养作用有关，同时还与外质体介导的编码IGF-1受体的mRNA的转运有关，后者增加了肾小管细胞对于生长因子的敏感性[23]。

MSC归巢、生存及效能

虽然大量的研究证据证实了MSC以改善顺铂[12]、甘油[22]或缺血再灌注损伤[18]诱导的AKI模型中实验动物的预后，但人们仍然会质疑MSC的迁移及其在受损组织中的低生存率会影响细胞移植的效果。MSC植入损伤部位的过程受很多受体的调控。在AKI肾组织中，基质细胞衍生因子1(SDF-1)表达上调，而SDF-1/CXCR4被认为在MSC的植入中发挥关键的作用[24]。MSC表达CD44，CD44通过与透明质酸(HA)的相互作用同样发挥重要的作用，而在AKI时，HA表达显著上调[25]。从CD44敲除的大鼠中分离出的BM-MSC丧失了迁移进入受损肾组织的能力，同时无法促进甘油诱导AKI大鼠的肾脏固有细胞形态及功能的恢复[26]。这有力支持了CD44/HA通路在MSC迁移中发挥作用。

目前人们正在研究新的方法来促使MSC迁移进入受损组织，以及增强其在组织中生存和再生的能力。这些方法包括在细胞输入体内之前进行生长因子、细胞因子、缺氧的预处理或基因修饰。研究表明，在缺血再灌注损伤动物模型及顺铂诱导的AKI动物模型中，促红细胞生成素(EPO)的预处理可显著增强MSC保护肾功能、抑制肾脏细胞凋亡的效能[25]。在顺铂诱导AKI的大鼠模型中，IGF-1的预处理可提高BM-MSC的运动能力及植入肾组织的能力，进而增强其保护肾功能、减轻肾小管损伤的作用。这是由于IGF-1的预处理增加了细胞自身IGF-1的产生，增加了细胞表面CXCR4的表达，而后者在BM-MSC的迁移中起重要作用，并降低了BM-MSC对氧化损伤的易感性[27]。另一种生长因子，胶质细胞系来源神经营养因子(GDNF)已经被证实可抑制氧化应激诱导的肾组织来源的MSC的凋亡[28]。GDNF的预处理可显著提高hAFS细胞植入AKI大鼠肾组织的能力，进而增强其旁分泌活性及保护肾脏的能力。这可能与GDNF促进培养的hAFS细胞表面表达更高水平的CD44、CXCR4和CX3CR1，进而生成IL-6、VEGF和SDF-1有关[29]。新近通过编码归巢受体，如CXCR4或VLA-4亚单元的逆转录病毒来对MSC进行基因修饰，以增强MSC的迁移活性[30]。基因修饰可使人类胚胎MSC产生的VEGF升高四倍，进而增强其对顺铂诱导AKI动物模型的肾脏保护作用[31]。此外，与未处理过的细胞相比，过表达肝细胞生长因子(HGF)的hCB-MSC对缺血再灌注损伤的AKI动物模型具有更好的治疗效果[32]。

MSC治疗肾脏疾病的临床研究现状

现阶段，美国FDA已批准了近60项基于MSC的临床试验，主要包括MSC应用于造血干细胞移植、修复组织损伤、治疗自身免疫性疾病及作为基因治疗的载体。其中，MSC治疗克罗恩病、移植物抗宿主病已经进入Ⅲ期临床试验阶段。虽然实验数据表明与传统的治疗方法相比，MSC可通过不同的途径更好地促进受损肾脏的修复，但是在肾脏疾病中，有关MSC实验研究向临床应用的转化依然有限。

Tan等[33]的研究表明，在ABO血型相符、交叉配血阴性的活体供肾移植中，与传统的抗IL-2受体抗体诱导疗法相比，自体BM-MSC的应用显著降低了经肾活检证实的急性排斥反应的发生率，更快地促进移植肾肾功能的恢复，同时明显减少了机会性感染。这是该领域全球第一个大规模的随机临床试验。Vanikar等[34]的研究则发现，在18个月的随访中，对于活体供肾移植，与单用免疫抑制剂相比，供者来源的hAD-MSC联合免疫抑制剂提高了移植肾的生存率。一项正在进行中的Ⅰ期临床试验(NCT00733876)试图探讨逐渐增加异基因MSC的剂量应用于具有高度术后AKI风险的开放性心脏手术患者的安全性和效能。初步的数据表明截止术后16个月，MSC的干预很好地保护了患者的肾功能，同时无一例患者需要血液透析，而对照组中有20%的患者发生了AKI。此外，MSC的干预可显著降低患者的平均住院日及再次入院率。在该试验中，目前尚未观察到与异基因MSC输注相关的不良反应，表明这种新型治疗方法应当是安全的[35]。

小结：大量的研究表明MSC在多种AKI动物模型中起保护作用。除了在受损部位的转分化外，MSC的旁分泌在肾脏的保护中也发挥着重要的作用。通过细胞因子等的预处理或基因修饰，MSC的归巢、生存及效能将获得增强，进而更好地发挥肾脏保护作用。然而，MSC的基础研究向临床的转化目前还停留在1期临床试验阶段，MSC应用于肾脏疾病的确切效果还需要进一步的基础与临床研究加以证实。

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(本文编辑 莫 非 凡 心)

The protection effect of mesenchymal stem cells in acute kidney injury

RENGuisheng,HUANGXianghua

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases,JinlingHospital,NanjingUniversitySchoolofMedicine,Nnajing210016,China

Acute kidney injury has now been a public health issue.Although great progress has taken place in the field of supportive treatment,the mortality and morbidity remain practically high level.To enhance the restricted regeneration capacity of kidney,some researches have attempted to apply mesenchymal stem cells of separate sources to treat acute kidney injury.These researches all manifest mesenchymal stem cells possess the ability of directional differentiation to damaged tissue cells and paracrine,which suggests promising prospect of repairing organs with acute damage.In this review,we are going to discuss the potential mechanism of mesenchymal stem cells promoting the regeneration of kidney tissue and their clinical applications.

mesenchymal stem cells acute kidney injury mechanism

南京军区南京总医院肾脏科 国家肾脏疾病临床医学研究中心 全军肾脏病研究所(南京，210016)

2014-08-11