大孔吸附树脂对喜树叶中喜树碱的纯化工艺研究

马云超，马珊珊，郭继业，宋 冰，丁孝营，徐珊珊

(1.吉林市农业科学院，吉林 吉林 132101；2.吉林市社会福利院，吉林 吉林 132012)

喜树碱(PT)为具有内酯环结构的喹啉类生物碱，继1966年Wall等首次从喜树植物中分离出喜树碱之后，人们对喜树碱的生物和化学性质进行了大量的研究，主要是针对抗肿瘤研究领域。喜树碱的抗癌作用，起初认为是喜树碱通过抑制核酸合成，导致癌细胞内DNA降解，近年来研究结果否定了这一观点，研究发现喜树碱主要是通过抑制癌细胞DNA复制酶，阻碍癌细胞的增殖。1988年又进一步发现喜树碱主要是通过阻断DNA拓扑异构酶I(Topoisonmerase I)合成，发挥细胞毒性的独特抗癌机理[1]。

传统工艺上，多用氯仿或氯仿/甲醇提取乙醇萃取液中的喜树碱，由于氯仿的高溶剂毒性及低选择性，导致氯仿萃取物中喜树碱含量较低且化合物复杂，给喜树碱精制和分离带来困难。

大孔树脂是20世纪70年代发展起来的一种高吸附性的有机高聚物，它包括大孔吸附树脂和大孔离子交换树脂[2]。大孔吸附树脂不含有离子交换基团，是以苯乙烯和丙烯酸酯为单体，加入交联剂和致孔剂，相互交联聚合而成多孔骨架结构，其吸附原理是利用自身巨大的表面积，通过范德华力与被吸附组分发生物理性作用，并依据化合物相对分子质量大小及吸附力强弱的差别，达到分离提纯的目的[3]。与其它柱层析吸附剂相比，大孔树脂具有吸附容量大、物理稳定性好、机械强度大、易被有机溶剂选择性洗脱、再生性良好的优势。

实验选用5种非/弱极性大孔吸附树脂，通过静态吸附与解吸实验，对树脂进行筛选。结合动态实验对树脂纯化工艺以及树脂再生性进行研究，从而确定利用大孔吸附树脂对天然产物中喜树碱分离的工业技术可行性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

所用溶剂除乙腈外均为分析纯；乙腈为高效液相色谱纯；蒸馏水及超纯水为实验室自制；喜树碱标准品质量分数为95.8%，喜树叶采自浙江桐庐浙江林学院培植基地四年生喜树；D101、D201、D402、AB-8、X-5大孔吸附树脂购于天津南开大学化工厂。

LC-6A高效液相色谱系统、UV-2450紫外检测器、AUY220型电子分析天平：日本岛津株式会社；KQ-500B超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DK-S14型恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；DGG-9240B型电热恒温干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 喜树碱样品液的制备与含量测定

称取喜树叶干粉，置于70 ℃的恒温水浴中，用体积分数65%的甲醇水溶液，料液比1∶10，回流提取1 h，37 ℃下减压浓缩，得到喜树碱的样品液。HPLC测定ρ(样品液)。

1.2.2 大孔吸附树脂的预处理与再生

将D101、D201、D402、AB-8、X-5 5种大孔吸附树脂用体积分数95%的乙醇浸泡2 d，倾去上浮物后抽滤，重复操作，直至乙醇洗涤液澄清且加水不产生乳白色浑浊现象，然后用大量蒸馏水浸没保存，备用。

1.2.3 大孔吸附树脂的静态吸附/解吸实验

取湿树脂各2.5 g，置于150 mL三角瓶中，加入0.175 mg/mL的喜树碱样品液100 mL，25±2 ℃震荡24 h。吸附平衡后，取清液1 mL，甲醇定容至10 mL，HPLC测定ρ(吸附残液)。

将吸附后的树脂洗涤抽滤，然后置于150 mL三角瓶中，加入体积分数95%的乙醇50 mL，在25±2 ℃下，震荡解吸24 h，解吸平衡后，抽滤，并用少量乙醇洗涤，合并滤液及洗涤液，用体积分数95%的乙醇定容至100 mL，HPLC测定ρ(解吸液)。

计算公式如下：

(1)

(2)

其中：ρ1为 解吸液质量浓度；ρ0为吸附液质量浓度；ρr为吸附残液质量浓度；V为吸附液体积；V1为解吸溶剂体积；m为树脂的干重。

1.2.4 大孔吸附树脂纯化工艺研究

1.2.4.1 大孔吸附树脂的吸附动力学曲线

取AB-8树脂2.5 g，加入ρ(喜树碱)为0.175 mg/mL的溶液100 mL，静态吸附10 h，分别于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h，各移取上清液1 mL，HPLC测定吸附残液中ρ(喜树碱)，绘制树脂的吸附动力学曲线。

1.2.4.2 大孔吸附树脂吸附透过曲线

取3支玻璃层析柱(20 mm×400 mm)，各加AB-8树脂30 mL(树脂干重5.51 g)，样品溶液上样，吸附流速2BV/h，每1BV收集一次，逐次标记，HPLC测定流出液中ρ(喜树碱)并绘制吸附透过曲线。

1.2.4.3 pH值对大孔吸附树脂的吸附性能影响

取AB-8湿树脂2.5 g，5份，分别加入pH=4、6、8、10、12的样品溶液100 mL，静态吸附24 h，HPLC测定ρ(吸附残液)。

1.2.4.4 ρ(洗脱液)对树脂洗脱性能的影响

取AB-8湿树脂2.5 g，5份，静态吸附24 h。将树脂抽滤洗涤后，置于150 mL三角瓶中，加入φ(乙醇)分别为30、50、70、80、95的乙醇50 mL，在25±2 ℃下，震荡解析24 h，HPLC测定ρ(解吸液)。

1.2.4.5 洗脱流速对树脂解吸性能的影响

将样品溶液700 mL，共3份，以2 BV/h吸附流速通过装有30 mLAB-8树脂的层析柱，平衡5 h，用3BV蒸馏水洗涤柱床，最后用体积分数95%的乙醇洗脱，洗脱流速为1、2、3 BV/h，洗脱体积9BV，HPLC测定流出液和洗脱液中ρ(喜树碱)。

1.2.4.6 树脂稳定性研究

将AB-8湿树脂2.5 g，按1.2.3方法解吸。解吸后，将树脂置于150 mL三角瓶中，加入50 mL体积分数95%的乙醇，磁力搅拌30 min对树脂再生，然后过滤，蒸馏水洗涤树脂，将再生后的树脂二次进行吸附与解吸，如此重复操作4次，HPLC测定各次ρ(吸附残液)。

2 结果与讨论

2.1 ρ(样品液)的测定

按1.2.1的方法操作，实验结果见表1。由于提取浓缩液是生产过程中可以直接获得浓度最高的喜树碱水溶液，故此实验中涉及的样品溶液ρ(喜树碱)，均为0.175 mg/mL。

表1 浓缩液中ρ(喜树碱)

2.2 大孔吸附树脂的静态吸附/解吸实验

按1.2.3方法，实验结果见表2。实验结果表明，D402型与AB-8型大孔吸附树脂对喜树碱有较大的吸附容量；D101型树脂次之； X-5与D201型树脂吸附量差异不大。

表2 静态吸附实验结果

按1.2.3方法，结果见表3。

表3 静态解析实验结果

由表3可见，X-5的解吸率最高，但其吸附能力较差；AB-8和D402具有较高的吸附与解吸能力，均适用于喜树碱的分离纯化，从成本考虑，优选AB-8型大孔吸附树脂进行工艺研究。

2.3 大孔吸附树脂纯化喜树碱工艺的研究

2.3.1 AB-8树脂吸附时间对吸附性能的影响

吸附时间对吸附性能的影响结果见表4。

表4 吸附动力学实验数据计算结果

实验结果表明，吸附时间超过5 h，吸附量增长趋于平缓，吸附几近饱和，所以确定吸附时间为5 h，吸附效果较好。

2.3.2 pH值对吸附性能的影响

pH值对吸附性能的影响结果见表5。

表5 pH值对树脂吸附性能的影响

结果表明，在pH=4～8，随着pH值增大，吸附容量也相应增加；当pH值大于8，吸附量有所下降，推测是喜树碱钠盐具有易氧化分解的不稳定性引起的，实验确定pH值对吸附量的影响并不大，考虑到简化工艺步骤，确定不调pH值上样。

2.3.3 吸附透过曲线的绘制

将0.175 mg/mL喜树碱样品溶液，以2 BV/h的吸附流速过树脂柱，HPLC测定流出液中ρ(喜树碱)，以流出液体积为横坐标，ρ(流出液)为纵坐标，绘制吸附透过曲线，结果见图1。

流出液体积/BV图1 喜树碱的吸附透过曲线

由图1所示，在吸附流速为2 BV/h的条件下，吸附溶液流经前18BV未发生泄露，从19BV开始，随着流出液体积的增加，泄露率不断增高，当流出液体积超过23BV，泄露曲线趋向平缓，表明树脂吸附已经接近饱和，此时吸附量为20.48 mg/g。

2.3.4 φ(乙醇)对树脂洗脱性能的影响

按1.2.4.4方法，结果见表6。实验表明，随着φ(乙醇)的升高，喜树碱的洗脱率也不断提高，体积分数95%的乙醇洗脱率最高，而且高φ(乙醇)进行洗脱，洗脱液便于浓缩，能够减少回收水分带来的目标物损耗，因此选择φ(乙醇)=95%的乙醇为洗脱溶剂。

表6 φ(乙醇)对树脂洗脱性能的影响

2.3.5 洗脱流速对树脂洗脱性能的影响

按1.2.4.5方法，结果见表7。实验结果表明，随着洗脱流速的增大，洗脱率逐渐降低，而且根据经验，洗脱流速通常控制在吸附流速的二分之一比较理想，故选择洗脱流速为1 BV/h。

表7 洗脱流速对树脂洗脱性能的影响

2.3.6 大孔吸附树脂的稳定性研究

按1.2.4.6方法，实验结果见表8。实验结果表明，新树脂和再生后的树脂吸附率差别大，再生后的树脂之间吸附率差别较小。

表8 树脂使用次数对吸附率的影响

2.3.7 AB-8树脂的最佳纯化工艺

取700 mL提取浓缩液通过装有30 mL AB-8湿树脂的层析柱(20 mm×400 mm)，按上述选定的上样、洗脱条件操作，每1BV收集一瓶，依次编号,GF254硅胶薄层点样跟踪，合并检出项，HPLC测定流出液及ρ(洗脱液)，计算树脂的吸附量和洗脱率，洗脱液经浓缩去醇，干燥后称量，计算洗脱物中喜树碱的纯度，结果见表9。

表9 树脂最佳工艺条件下动态性能参数

经GF254硅胶薄层点样跟踪，1～8号瓶在紫外光下，喜树碱斑点可见，第9号瓶开始无喜树碱检出，合并1～8号瓶，HPLC测定洗脱液中ρ(喜树碱)，在选定的上样、洗脱条件下，φ(乙醇)=95%洗脱8BV，洗脱率可达83.1%，洗脱物中喜树碱质量分数大于7%，说明AB-8大孔吸附树脂对喜树叶粗提液的净化效果良好，效率高，工艺可行。

3 结 论

结合大孔吸附树脂静态吸附与解吸实验结果进行筛选，优选出AB-8大孔吸附树脂，并对树脂的上样、洗脱条件的相关参数进行考察，确定AB-8大孔吸附树脂纯化喜树碱粗提液的最佳工艺为：将浓缩液不调pH值上样，上样流速2 BV/h，平衡吸附5 h；用体积分数95%的乙醇以1 BV/h流速进行洗脱，洗脱量为8BV。该条件下洗脱物中喜树碱质量分数大于7%，通过对树脂再生性能的考察，发现新树脂吸附一次后，吸附率下降约30%，每次使用后需对树脂进行系统地再生。

[ 参 考 文 献 ]

[1] Hiang YH,Herizberg R,Hecht S,et al.Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase I [J].Biol Chem,1985,260:14873-14878.

[2] 李善吉,伍胜君.大孔树脂的应用概况[J].广东轻工技术学院学报,2005,4(2):11-13.

[3] 刘彬果,郭文勇,钟蕾,等.大孔树脂吸附技术在中药中的应用[J].解放军药学学报,2003,19(6):452-455.