同步荧光光谱法研究叶酸与牛血清白蛋白的相互作用*

王 珊，高奕红，高丰琴

(咸阳师范学院 化学与化工学院，712000)

血清白蛋白具有重要的生理功能，可与许多内源、外源性化合物结合[1]，是药物发挥药效的重要载体和靶分子[2-4]。因此定量检测血清蛋白质在生物化学、临床医学、食品科学等方面具有重要的意义。目前,有LOWRY法[5]、凯氏定氮法[6]、BRADFORD法[7]、化学发光法[8]及电化学法[9]等方法,但存在准确度或灵敏度不够高,方法线性范围窄、费时等缺点。作者以叶酸与牛血清白蛋白(BSA)相互作用时会引起BSA荧光淬灭为基础,固定BSA浓度，研究不同浓度叶酸存在下BSA的荧光光谱变化,进而为建立一个操作简单、灵敏度高、线性范围宽的测定蛋白质浓度的新荧光光谱分析法提供理论依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

牛血清白蛋白：分析纯，百灵威试剂公司；叶酸：分析纯，郑州天健生物技术有限公司；其它试剂均为市售分析纯。

RF-5301PC荧光分光光度计：美国PE公司；UV-Vis Specord50 型紫外-可见分光光度计：德国耶拿公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器：南京超声仪器有限公司。

1.2 实验步骤

1.2.1 配制Tris-HCl缓冲溶液

(1) 先称3.634 2 g三羟甲基氨基甲烷,用少量蒸馏水溶解，配成0.1 mol/L的Tris溶液。

(2) 稀释定量的盐酸至浓度为0.1 mol/L。

(3) 在天平上称量氯化钠固体1.2 g，然后加入41 mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌使氯化钠固体溶解，配制成浓度为0.5 mol/L的氯化钠溶液。

(4) 量取250 mL，0.1 mol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液于烧杯中，再加入210 mL 0.1 mol/L的盐酸溶液，加入适量的氯化钠溶液，用盐酸和氢氧化钠调节混合溶液pH至7.40(用酸度计检测)，最后用蒸馏水加至刻度处,于冰箱4 ℃保存备用。

1.2.2 溶液的配制

用电子分析天平准确称取0.667 g的牛血清白蛋白固体，注意在称量纸上称量。再加入一定量的蒸馏水，然后利用磁力搅拌器进行粉碎溶解(溶解时不能加热，也不可长时间见光)，再定容到500 mL容量瓶中,得到浓度是1.0×10-6mol/L的牛血清白蛋白溶液。

取5片叶酸片，加入15 mL质量分数为0.5%的氨水溶液溶解(应充分溶解，并且不能加热)，再加入蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，并避光低温保存在恒温箱中.得到1.0×10-3mol/L FA溶液。

1.2.3 荧光光谱测定

在10 mL的比色管中加入3.0 mL BSA溶液，2.0 mL Tris-HCl缓冲溶液、2.0 mL NaCl溶液溶液，稀释至刻度，摇匀、静置5 min。准确移取3.0 mL该溶液于石英比色皿中，用微量进样器逐次加入叶酸溶液，得到叶酸浓度依次递增的7组混合溶液，摇匀静止10 min，测定荧光发射光谱。

1.2.4 同步荧光测定

由于牛血清白蛋白中的3种有荧光特性的芳香族氨基酸的荧光光谱发射峰在一定条件下重叠较大,常规荧光扫描光谱难以把它们的特征光谱区分,所以采用同步荧光光谱扫描，并以此发射波长的改变情况判断蛋白质的构象变化。保持BSA浓度不变，每次加入10 μL的叶酸溶液，调节发射波长与激发波长的Δλ=60 nm和Δλ=15 nm，并记录300～450 nm的同步荧光光谱。

1.2.5 紫外光谱测定

利用SPECORD 50型紫外可见分光光度计，以BSA溶液作为参比，将不同浓度的叶酸加入到BSA溶液中，每次加完溶液,充分混合20 min，在波长200～550 nm进行紫外测定，并记录各个浓度的最大吸收波长。

1.2.6 金属离子对反应的影响

生命体中含有微量的金属离子,当小分子物质与牛血清白蛋白作用结合时,金属离子会对作用结果产生影响。实验研究加入Mg2+、Cu2+、Ca2+和Zn2+等离子后对叶酸与BSA结合反应的影响变化。

2 结果与讨论

2.1 牛血清白蛋白与叶酸相互作用紫外光谱研究

FA与BSA作用的紫外光谱见图1，其中c(BSA)=1.0×10-6mol/L；1～7为c(FA)=0、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6、10×10-6、12×10-6mol/ L。由图1可知,加入叶酸后牛血清白蛋白的紫外光谱的峰形基本没发生变化,在280 nm附近的吸收峰强度明显变化，说明叶酸使蛋白质的构象发生改变。叶酸浓度较低时,叶酸与牛血清白蛋白结合有利于蛋白质分子的构象改变；当叶酸的浓度进一步升高时,叶酸分子诱导蛋白分子发生蛋白质二级，三级结构迅速改变。

λ/nm图1 FA与BSA作用的紫外光谱

2.2 牛血清白蛋白与叶酸相互作用的荧光光谱分析

蛋白质中的荧光主要来自色氨酸残基和酪氨酸残基，而荧光变化直接反映出蛋白质中色氨酸残基本身和周围的变化。以激发波长280 nm时，在350 nm附近出现荧光光谱的最大发射波长。研究牛血清白蛋白的荧光光谱随叶酸浓度增大而变化的情况，见图2，其中c(BSA)=1.0×10-6mol/L；1～7为c(FA)=0、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6、10×10-6、12×10-6mol/L。实验结果表明,BSA的浓度一定时，随着叶酸的浓度缓慢增加，BSA的内源荧光会发生有规律的猝灭，即说明它们发生了相互作用，但牛血清白蛋白的最大发射波长(λem=350 nm)保持不变，发生了荧光的淬灭。

λ/nm图2 298 K时FA与BSA作用的荧光光谱

2.3 荧光猝灭机理

蛋白质荧光猝灭机理主要分为静态猝灭和动态猝灭。根据Stern-Volmer 方程得：

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式中：F0和F分别为未加小分子和加入小分子以后的荧光强度；Kq为动态荧光猝灭速率常数；Ksv代表Stern-Volmer猝灭常数，Ksv值越大,则说明小分子与BSA 间的相互作用越强；[Q]代表小分子的浓度；τ0为没有猝灭剂存在下测得的荧光寿命(τ0≈10-8s)。

能发生猝灭的小分子对生物大分子蛋白质的最大扩散速率常数为2.0×1010L/(mol·s)。设FA对BSA的荧光猝灭过程为动态猝灭,则作出298 K下叶酸对BSA荧光猝灭的Stem-Volmer 曲线,见图3，其中c(BSA)=1.0×10-6mol/L；c(FA)=2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6、10×10-6、12×10-6mol/ L。由直线的斜率可求出KSV=9.25×104L/mol,进一步求得Kq=9.25×1012L/(moL·s)。远远大于各类猝灭小分子对生物大分子蛋白质的最大扩散碰撞猝灭速率常数2×1010L/(moL·s),即说明FA对BSA的荧光猝灭是静态猝灭而非动态猝灭。

c/10-5 mol/L图3 FA与BSA作用的Stem-Volmer曲线

2.4 FA与BSA的结合常数及结合位点数

假设FA在BSA上有n个相同且独立的结合位点,由表达式：

lg[(F0-F) /F]=lgK0+nlg[Q]

(2)

则以lg[(F0-F)/F]对lgcq作图,见图4，其中c(BSA)=1.0×10-6mol/L；c(FA)=0、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6、10×10-6、12×10-6mol/L，其线性方程的斜率和截距分别为结合点位数n和lgK0，即结合点位数n=0.981,结合常数K0=9.98×103L/mol，说明二者相互作用的结合位点数可能是1个，结合常数的数量级在104L/mol以上。

lgcq图4 FA与BSA作用的双对数曲线

2.5 同步荧光研究

FA与BSA的同步荧光光谱见图5，其中c(BSA)=1.0×10-6mol/L；1～7为c(FA)=0、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6、10×10-6、12×10-6mol/ L。同步荧光光谱中最大波长发生极小蓝移，即BSA分子内色氨酸残基和络氨酸残基由于小分子叶酸的加入而所处微环境发生改变，色氨酸残基和酪氨酸残基疏水环境增强,表明BSA的分子构象发生改变。且随着叶酸的依次加入,峰强度逐渐减弱。

λ/nm图5 FA与BSA作用的同步荧光光谱图

2.6 金属离子对实验的影响

金属离子溶液的加入影响了药物分子和BSA的结合，见图6，其中c(BSA)=1.0×10-6mol/L,c(FA)=c(Ca2+)=c(Cu2+)=c(Zn2+)=c(Mg2+)=1.0×10-5mol/L, 1为BSA+10 μL FA (Mg2+)，2为BSA+10 μL FA+ Zn2+，3为BSA+10 μL FA + Ca2+，4为BSA+10 μL FA+ Cu2+。由图6可知，Cu2+、Ca2+和Zn2+的加入使得BSA的内源荧光也发生猝灭，Mg2+无影响。

λ/nm图6 金属离子对FA与BSA影响作用的荧光光谱图

3 结 论

牛血清白蛋白与叶酸药物分子发生了较强的相互作用,叶酸可以使牛血清白蛋白的内源荧光发生有规律的猝灭,且该荧光猝灭过程是一个静态猝灭过程。并且通过参数计算表明，FA与BSA的结合常数在104L/mol数量级以上,结合位点数可能为1个。金属离子溶液的加入可影响药物分子和BSA的结合，Cu2+、Ca2+和Zn2+的加入使得BSA的内源荧光也发生猝灭，Mg2+无影响。该方法对建立蛋白质分析方法研究具有重要的意义。

[ 参 考 文 献 ]

[1] 薛泽春，程新胜，杨丽文.尼古丁猝灭牛血清蛋白荧光机制的研究[J].上海交通大学学报：农业科学版，2006，24(1)：44-47.

[2] 张国文，张玉珍，阙青民.磺胺二甲氧嘧啶与牛血清白蛋白相互作用的研究[J].南昌大学学报：工科版，2006，28(4)：316-318.

[3] 陈克海，郑学仿，郭明，等.长春新碱与人血清白蛋白的相互作用研究[J].化学学报，2007，65(17)：1887-1891.

[4] Wei X L，Xiao J B，Wang Y F，et al.Which model based on fluorescence quenching is suitable to study the interaction between trans-resveratrol and BSA[J].Spectrochim Acta：A，2010，75(1)：299-304.

[5] Lowry O H,Rosebrough N J,Farr A L,et al.Protein measurem ent with the folin phenol reagent [J].J Biol Chem,1951,193(1)：265-275.

[6] 李海玲,彭书明,李凛,等.4种常用蛋白质浓度测定方法的比较[J].中国生化药物杂志,2008,29(4) ：277-278.

[7] Bradford M M.A rapid and sensitive method for thequantitation of microgram quantities of protein utilizingthe principle of protein-dye binding [J].Anal Biochem,1976,72：248-254.

[8] 李永新,赵丹华,卓淑娟,等.鲁米诺-四磺基锰酞菁-过氧化氢化学发光体系在蛋白质测定中的应用[J].分析化学,2003,31(5) ：638-641.

[9] 孙伟,韩军英,焦奎,等.钍试剂线扫极谱分析法测定蛋白质的研究[J].分析科学学报,2006,22(2) ：145-148.