二甲苯体外诱导肾小管上皮细胞损伤的表观遗传机制

2015-06-08曹香华秦卫松徐忠秀陈朝红郑春霞曾彩虹刘志红

肾脏病与透析肾移植杂志 2015年2期

曹香华秦卫松徐忠秀陈朝红郑春霞曾彩虹刘志红

曹香华秦卫松徐忠秀陈朝红郑春霞曾彩虹刘志红

目的：研究二甲苯诱导肾小管上皮细胞损伤的特点及表观遗传机制。方法：不同浓度的二甲苯分别作用于体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)，通过ELISA法检测肾小管上皮细胞培养上清中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)表达变化，流式技术检测肾小管上皮细胞凋亡，Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3活性。采用人甲基化450K芯片和焦磷酸测序对二甲苯诱导损伤的肾小管上皮细胞DNA 的CG位点进行甲基化筛选和验证。结果：二甲苯诱导刺激后HK-2细胞NGAL表达增加，呈现剂量和时间依赖性； 1.4 mmol/L二甲苯作用48h后培养上清中NGAL的值较对照组显著增加[(4.52±0.49) pg/mlvs(2.30±0.11)pg/ml,P<0.01] 。随加入二甲苯浓度的增加，HK-2细胞的凋亡比例和Caspase-3活性明显增加。甲基化芯片分析结果显示，二甲苯刺激后，HK-2细胞有243条探针甲基化出现显著差异，其中109条探针显示为甲基化水平增高，134条探针显示为甲基化水平降低，共涉及到138个基因。其中，细胞凋亡相关的基因(如Bax、FAF1等)出现了明显的甲基化改变， FAF1甲基化水平降低，Bax甲基化水平升高。焦磷酸测序的分析结果显示，二甲苯刺激后Bax基因(92%)的甲基化水平与对照组(85%)相比出现7%的甲基化改变; FAF1基因的甲基化水平比对照组降低6%，其甲基化改变的趋势与芯片结果相一致。结论：二甲苯刺激可引起HK-2细胞的损伤和凋亡增加，Bax、 FAF1等凋亡相关基因的甲基化水平改变可能参与二甲苯对肾小管上皮细胞损伤，其机制有待进一步研究。

二甲苯肾小管上皮细胞凋亡中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 DNA甲基化

有机溶剂相关性肾病临床表现典型的肾病综合征，同时伴严重小管损害，免疫抑制剂治疗无效，临床找不到明确病因，在询问病史时发现，这些患者在发病前均有明确有机溶剂接触史[1]。有机溶剂相关性肾病的病理表现多样，包括肾小管上皮细胞刷状缘脱落、细胞变性、坏死或脱落，足细胞足突融合、足细胞肿胀、空泡变性甚至坏死[2-5]。动物实验研究证实大鼠吸入有机溶剂后可出现明确的肾脏损伤[6]。

有机溶剂本质上属于碳氢化合物，是指脂肪族、脂环族、芳香族、卤族及氧化碳氢化合物、乙烯醇类及用于多种工业加工和家庭使用的碳氢化合物。有机溶剂主要来源于工作环境和家庭装修，种类繁多。二甲苯常作为溶剂广泛用于涂料、树脂、染料、油墨等行业；作为合成单体或溶剂用于医药、炸药、农药等行业。由于国家对油漆等材料中苯的含量制定了严格的标准，因此近年来油漆等有机溶剂的污染主要以二甲苯超标为主。目前关于二甲苯与肾脏疾病的相关研究还较少，对于有机溶剂导致肾脏损伤机制尚不清楚，近年研究发现表观遗传机制在有机溶剂导致的疾病中发挥重要作用。本研究通过建立二甲苯诱导肾小管上皮细胞损伤的细胞模型，观察二甲苯诱导肾小管上皮细胞损伤后的细胞表型改变，并对其损伤机制进行探讨。

材料和方法

材料

二甲苯购自南京化学试剂有限公司，分析纯；实验用二甲苯需新鲜配制，将二甲苯溶于DMSO并避光保存，DMSO终浓度不超过1%。

细胞人肾小管上皮细胞株(HK-2)购自ATCC(CRL-2190TM)，培养基为DMEM/F12，含10%FBS，培养于37℃，5% CO2。

试剂和抗体胎牛血清购自杭州四季青生物工程技术研究所，NGAL ELISA试剂盒购自Antibody公司， Annexin V-FITC试剂盒购自Biouniquer公司，caspase-3活性检测试剂盒购自碧云天。

方法

细胞培养与处理将肾小管上皮细胞接种于25 cm2培养瓶和96孔板，待其长至80%融合后，分别予以不同浓度二甲苯处理6、12、24、48h，每隔12h更换含有二甲苯的新鲜培养基。细胞实验分组如下：(1)正常对照组：用完全培养基培养；(2)阴性对照组：以不含二甲苯，含1% DMSO的完全培养基处理；(3)二甲苯处理组：培养基中二甲苯的浓度分别为1.0 mmol/L、1.4 mmol/L、1.8 mmol/L、2.0 mmol/L。

ELISA 将细胞接种于96孔板，贴壁后给予1%DMSO和1.0 mmol/L、1.4 mmol/L、1.8 mmol/L二甲苯处理6h、12h、24h、48h，通过ELISA法检测培养上清中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)浓度，实验步骤参照Antibodyshop公司ELISA试剂盒说明书。

流式细胞仪分析肾小管上皮细胞凋亡肾小管上皮细胞分组处理后经0.25%胰酶消化制成细胞悬液，离心收集细胞，参照Annexin V-FITC试剂盒说明书处理细胞，使用两种荧光染料，分别为Annexin V-FITC(5 μl，避光，染色15～20 min)和碘化丙啶(PI，5 μl,置于冰上染色15～20 min)。

Caspase-3活性检测肾小管上皮细胞分组处理后经0.25%胰酶消化制成细胞悬液，离心收集细胞，具体步骤参照Caspase-3活性检测试剂盒说明书。

细胞DNA提取肾小管上皮细胞，分组处理后经0.25%胰酶消化制成细胞悬液，离心收集细胞，细胞DNA提取的具体步骤参照QIAamp DNA Mini Kit说明书。

甲基化450K芯片使用HumanMetylation450K，V1.0芯片扫描仪配套Illumina的genomestudio软件分析数据。首先通过芯片图像分析软件对芯片灰度扫描图进行分析，可以得到芯片上每个基因点的原始信号值，即所有有效重复点的前景信号值减去背景信号值的平均信号值(Average Beta),Detection P value,Diffscore值等。根据这些参数值进行后续的数值分析。差异甲基化基因的筛选标准：实验组样本Diffscore值<-13或>13；且Delta Beta>0.1或<-0.1，即为差异甲基化基因。Delta Beta值为control 与case组Average Beta相差的结果，即实验组与对照组在每个位点的甲基化的差异程度。

焦磷酸测序具体实验步骤如下：(1)DNA模板的制备：从细胞中抽提基因组DNA，按照碧云天基因组DNA小量抽提试剂盒(编号：D0063)说明书操作；(2)亚硫酸氢盐处理：亚硫酸氢盐处理样本DNA采用Qiagen公司的EpiTect Bisulfite Kit试剂盒，样本的起始量为1 μg；(3)PCR扩增：用ABI 9700 PCR扩增仪对目标片段扩增；(4)PCR引物序列:FAF1-F:GAAAGGTTTATAGTTAAGAAAGTAGTTAT，FAF1-R:Biotin-TAATTACTAATACCACCTTCTCATTCC；BAX-F:TTGGAGTGTAGTAGTGATTATAGTT，BAX-R:Biotin-CCAAAAAAAAATATCCCTCCCTATTAAA；FAF1测序引物： TTTTTTGTTTTTAAAAGTATTGTA，BAX测序引物序列：CCCTATTAAAAACCAACCT。荧光定量PCR扩增体系和反应条件(PCR试剂来自TakaRa)：总反应体系为40 μl，包括10×PCR buffer 4μl，dNTP(10mM) 0.8 μl，上下游引物各(10 μmol/L)0.8 μl，QIAGEN hotstart Taq 0.5 μl(2.5U)，用ddH2O补足至40 μl。PCR反应条件：95℃ 3 min；50个循环(95℃ 15 sec；52℃ 30 sec；72℃ 30 sec)；72℃ 5 min。亚硫酸氢盐处理样本2 μl。(5)Pyrosequencing焦磷酸测序：采用焦磷酸测序仪配套的单链DNA分离装置从40 μl PCR反应液中分离单链DNA；对分离出来的单链DNA进行焦磷酸测序(测序仪型号PyroMark ID，Qiagen，试剂名称：PyroMark Gold Q96 Reagent，Qiagen)；采用焦磷酸测序仪配套的分析软件进行甲基化结果分析。

统计学处理应用SPSS 16.0统计分析软件对实验结果进行统计学处理，实验结果以均数±标准差表示，采用方差分析检验对各组数据进行比较，采用 2-ΔΔCT法处理甲基化芯片得到的数据，两组数据之间的比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为统计学差异显著。

结果

二甲苯诱导人HK-2细胞的损伤在培养的HK-2细胞中加入不同浓度二甲苯(1.0、1.4、1.8 mmol/L)，以1%DMSO为阴性对照组，检测培养液上清中NGAL的表达，考察二甲苯对HK-2细胞的损伤作用。发现随着二甲苯浓度的增加，细胞分泌NGAL明显增加，1.8 mmol/L(P<0.01)刺激组在刺激24h后可见到NGAL表达显著增加(图1)。随着二甲苯处理时间的延长，刺激48h后HK-2细胞的损伤作用明显，用二甲苯处理24h(P<0.01)和48h(P<0.01)后HK-2细胞分泌NGAL明显增加(图1)。

图1 二甲苯对人肾小管上皮细胞分泌NGAL的影响NGAL：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白；*：与DMSO对照组比较，P<0.01

二甲苯诱导后HK-2细胞凋亡增加在培养的HK2细胞中加入不同浓度二甲苯培养48h后，检测二甲苯诱导后HK-2细胞的凋亡比例，考察二甲苯对HK-2细胞的凋亡作用。发现随着二甲苯浓度的增加，HK-2细胞的凋亡数量明显增加，在1.0 mmol/L和2.0 mmol/L之间细胞凋亡数目明显升高，2.0 mmol/L浓度的二甲苯引起近98%的细胞凋亡(图2A、B)。用含不同浓度二甲苯(1.0 mmol/L、1.4 mmol/L、1.8 mmol/L)的培养基培养HK-2细胞，48h后可观察到随着二甲苯浓度的增高，HK-2细胞的Caspase-3活性也相应增加(图2C)。

人HK-2细胞经二甲苯刺激后DNA甲基化谱的改变 Illumina Human甲基化450K芯片能够覆盖约450 000多个甲基化位点，HK-2细胞经二甲苯刺激后用450K芯片分析发现，有243条探针甲基化出现差异，其中109条探针显示为甲基化水平增高，134条探针显示为甲基化水平降低。与1%DMSO对照组相比，二甲苯刺激组共有138个基因发生明显的甲基化改变。差异甲基化基因的功能分析结果提示，二甲苯刺激组DNA甲基化差异主要集中在细胞组成、凋亡相关以及细胞周期蛋白和生物功能等相关基因。与细胞凋亡相关的有3个基因(表1)，其中BAX出现甲基化水平升高，FAF1出现甲基化水平降低。

图2 二甲苯诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)的凋亡A：不同浓度二甲苯刺激48h后HK-2细胞凋亡情况(A1：正常对照组；A2：DMSO对照组；A3：1.0 mmol/L二甲苯组；A4：1.4 mmol/L二甲苯组；A5：1.8 mmol/L二甲苯组)；B：1.8 mmol/L二甲苯刺激48h后HK-2细胞凋亡的数目；C：不同浓度刺激后Caspase-3活性检测;#：与DMSO对照组比较，P<0.001

凋亡基因染色体上的位置家族在HK-2细胞中的功能DiffscoreDeltaBetaBetavalue甲基化水平FAF1Fas-FasL途径凋亡相关蛋白介导细胞凋亡-19.373-0.1780.386低甲基化Baxchr9:96713326-96718186Bax/Bcl2凋亡相关蛋白抑制细胞凋亡19.3470.1120.182高甲基化

Delta Beta：二甲苯实验组与1%DMSO对照组在每个位点的甲基化的差异程度,负值表示与对照组相比为低甲基化位点，正值为高甲基化位点；Beta value：甲基化改变的比例，其值在0(完全未甲基化)和1(完全甲基化)之间不断变化

焦磷酸测序验证HK-2细胞经二甲苯刺激后凋亡相关基因甲基化改变焦磷酸测序的分析结果显示，二甲苯刺激后Bax基因(92%)(图3A)的甲基化水平与对照组(85%)(图3B)相比出现7%的甲基化改变；FAF1基因的甲基化水平比对照组降低了6%(图3C～E)。

讨论

南京军区南京总医院肾脏科每年收治数十例因接触有机溶剂引起的肾脏疾病，这些患者均以水肿、大量蛋白尿起病。肾活检病理观察显示肾小球足细胞和肾小管上皮细胞存在严重损伤，其致病机制到目前为止并不十分清楚。动物实验研究已证实大鼠吸入有机溶剂后可出现明确的肾脏损伤[6]。

有机溶剂广泛存在于工作环境和新装修的居住环境中，种类繁多，本研究中，我们选择二甲苯开展实验研究。二甲苯常作为溶剂广泛用于涂料、树脂、染料、油墨等行业；作为合成单体或溶剂用于医药、炸药、农药等行业。有机溶剂的损伤机制至今仍不十分清楚，有学者报道称，有机溶剂可通过介导免疫反应导致肾组织损伤[7]；也有研究者认为，有机溶剂可对肾小管产生直接毒性作用[8]。近年的研究发现，有机溶剂等环境因素可通过改变表观遗传修饰导致细胞的凋亡损伤和疾病的发生。例如有研究报道，孕妇接触多环芳香类有机溶剂可以导致脐血细胞基因组的DNA整体甲基化水平的增加[9]。Chen等[10]研究也证实，有机溶剂能通过氧化应激作用引起细胞DNA断裂。2011年3月，在美国召开了首届环境表观遗传学国际大会[11]，探讨了环境因素的表观遗传效应、对基因表达的影响，以及与肿瘤、衰老、免疫疾病与中枢神经系统疾病等多种疾病的关系[12,13]。

NGAL是一种25 kD的蛋白，与中性粒细胞明胶酶共价结合，它通过改善细胞内辅酶铁的代谢来调节多种参与细胞生命重要蛋白质的合成[14,15]。NGAL主要表达于肾脏近曲小管上皮细胞，但也存在于远侧肾单位[16]，这提示NGAL与肾脏中肾小管关系密切，本研究通过检测体外培养的HK-2细胞中NGAL浓度来判断有机溶剂二甲苯能否导致肾小管损伤，结果发现随着二甲苯浓度的增加，细胞分泌NGAL明显增加，对HK-2细胞的损伤也较严重。随着二甲苯处理时间的延长，刺激24h和48h后HK-2细胞分泌NGAL明显增加，尤以刺激48h后HK-2细胞的损伤较为显著。

环境暴露导致的肾脏疾病可能与肾小管上皮细胞的增殖与凋亡之间的失衡有关，本研究通过流式细胞技术检测了二甲苯刺激后HK-2细胞的凋亡数目增加，这种增加与二甲苯浓度成正相关，随着二甲苯浓度的增加，HK-2细胞的凋亡数量明显增加，尤其在1.0 mmol/L和2.0 mmol/L之间细胞凋亡数目升高明显，2.0 mmol/L浓度的二甲苯引起近98%的细胞凋亡。Caspase-3的活化是凋亡发展过程中的关键环节，Caspase级联效应一旦激活，意味着凋亡的发生不可避免，本研究通过检测二甲苯刺激后HK-2细胞Caspase-3活性，进一步证实了二甲苯刺激可以导致HK-2细胞凋亡。

到目前为止，关于有机溶剂是否可通过DNA甲基化的改变导致肾脏疾病发生的研究还很少。本研究中我们采用人类甲基化450K BeadChip芯片，该芯片可检测人全基因组45万个甲基化位点，全面覆盖了96%的CpG岛，还有CpG岛以外的CpG位点、人类干细胞非CpG甲基化位点、正常组织与肿瘤(多种癌症)组织差异甲基化位点、编码区以外的CpG岛、miRNA启动子区域和已通过GWAS的疾病相关区域的位点[17]。本实验采用该芯片，首次从基因组范围对二甲苯诱导的肾小管上皮细胞的DNA甲基化水平进行了研究，结果显示与1%DMSO对照组相比，二甲苯刺激组肾小管上皮细胞共有138个基因的DNA甲基化水平发生改变，其涉及细胞组成、凋亡相关以及细胞周期蛋白类和生物功能等多个功能，我们推测二甲苯刺激导致HK-2细胞凋亡增加的原因可能是关键凋亡基因的DNA发生甲基化改变介导的。

促凋亡的相关基因Bcl-2/Bax、caspase-3、Fas/Fasl在肾间质疾病中起着重要的作用，Fas/Fasl在肾小管上皮细胞的高度表达、细胞内Bcl-2与Bax比值失调、Caspase-3活性增加均与凋亡发生有关。通过分析甲基化450K芯片结果，我们发现与细胞凋亡相关的基因(如Bax、FAF1等)出现了明显的甲基化改变，其中FAF1甲基化水平降低，Bax甲基化水平升高。焦磷酸测序的验证结果显示，与1%DMSO对照组相比，二甲苯刺激组Bax基因甲基化增高，而FAF1基因甲基化的降低。FAF1是Fas-FasL信号转导通路下游的凋亡信号分子，属于肿瘤坏死家族受体的一员，当Fas配体与抗Fas抗体结合后，介导细胞凋亡的发生。FAF1可以直接作用于真核生物或哺乳动物正常或突变细胞Fas基因的胞浆区域，FAF1是调控凋亡发生的关键信号转导分子，能够通过Fas促进细胞凋亡的发生[18]。本研究结果显示，二甲苯刺激可导致FAF1基因甲基化水平降低，推测其甲基化水平改变可能介导HK-2细胞凋亡的作用增加。Bax属于BCL-2凋亡调控的家族成员，定位于线粒体水平中不可逆转细胞损害的上游，物理射线、化疗药物和其他形式的毒物吸收会导致Bax的表达大量增加，在细胞的存亡中起着至关重要的作用。Bax以单体的形式存在于胞质或细胞膜中，受到凋亡的信号刺激，胞质中的Bax单体转录到线粒体中变成整合的膜蛋白、二聚体或低聚物，引起细胞凋亡的发生[19-21]。本研究的结果显示二甲苯刺激可导致Bax甲基化水平升高，从而抑制基因的表达，导致HK-2细胞凋亡通路的活化，Caspase-3活性增加，细胞凋亡增加。

本研究通过检测代表肾小管损伤的标志物NGAL的表达情况，证实了二甲苯刺激可以导致HK-2细胞的损伤， HK-2细胞的凋亡明显增加，芯片结果也显示二甲苯刺激组与1%DMSO对照组相比，出现了凋亡基因Bax和FAF1明显的甲基化改变，我们推测二甲苯刺激导致HK-2细胞凋亡增加的原因可能是关键凋亡基因的DNA发生甲基化改变介导的,其机制仍需要进一步的研究加以证实。

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(本文编辑逸沐)

Epigenetic mechanisms of xylene-induced renal tubular epithelial cell injury

CAOXianghua,QINWeisong,XUZhongxiu,CHENZhaohong,ZHENGChunxia,ZENGCaihong,LIUZhihong

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases,JinlingHospital,NanjingUniversitySchoolofMedicine,Nanjing210016,China

LIUZhihong(E-mail:liuzhihong@nju.edu.cn)

Objective：To investigate the characteristics of proximal tubule epithelial cells injury and the epigenetic mechanism of the injury induced by organic solvents. Methodology：Human proximal tubule epithelial cells were treated with different concentrations of xylene. The NGAL in the culture medium was measured by ELISA, the apoptosis of tubular cells was detected by flow cytometry and the Caspase-3 activity was detected by kit. The Illumina Infinium Human Methylation 450 (450K) Bead Chips were used to detect the methylation changes in HK-2 cells after xylene treatment. The data of Illumina chips were validated by pyro-sequencing method. Results：The secretion of NGAL was increased in dose-and time-dependent manner after xylene treatment. The NGAL was increased significantly [(4.52±0.49) pg/mlvs(2.30±0.11) pg/ml,P<0.01] after 48 h treatment with 1.4 mmol/L xylene. At the same time, with increasing concentrations of xylene, the ratio of HK-2 cells apoptosis and Caspase-3 activity was significantly increased. Xylene treatment induced DNA methylation changes, indicating by 243 probes in HK-2 cells after xylene stimulation, with 109 probes displayed increased levels of methylation and 134 probes showed reduced levels of methylation. The methylation changes of 138 genes were indicated by these probes, including apoptosis related gene, e.g. Bax, FAF1, etc. The DNA methylation of FAF1 was decreased while the DNA methylation of BAX was increased. The pyrosequencing assays showed that Bax gene methylation level changes of xylene stimulation group was 7% compared to control group, and FAF1 gene was 6%, its methylation change trend was consistent with the results of the chip. Conclusion：Xylene stimulation can cause HK-2 cells injury and increased apoptosis. The changes of DNA methylation level of Bax, FAF1 might involve in xylene induced injury.

Xylene tubular epithelial cell apoptosis NGAL DNA methylation

国家重点基础研究发展计划[973计划(2012CB517600)(2012CB517605)]；国家自然科学基金(81270811)

南京大学医学院附属金陵医院(南京军区南京总医院)肾脏科博士研究生(曹香华)，国家肾脏疾病临床医学研究中心全军肾脏病研究所(南京，210016)

刘志红(E-mail:liuzhihong@nju.edu.cn)

2014-01-20