大鼠肾性骨病模型皮质骨骨量及结构的变化

2015-06-08杨国柱陆幸妍李青南

肾脏病与透析肾移植杂志 2015年2期

陈珺孟彦钟雁张豪杨国柱陆幸妍李敏左力李青南

大鼠肾性骨病模型皮质骨骨量及结构的变化

陈珺1孟彦2钟雁1张豪1杨国柱1陆幸妍1李敏1左力2李青南1

目的：观察腺嘌呤联合高磷饮食建立的肾性骨病模型大鼠的皮质骨骨量和骨结构的形态学变化，并探讨其骨矿代谢情况及机制。方法：3月龄雄性SD大鼠24只，随机分为腺嘌呤模型组(M组，1～4周予含腺嘌呤的高磷饮食，5～6 周高磷饮食饲养)和高磷饮食对照组(C组，高磷饮食饲养6周)；皮下注射钙黄绿素进行体内双荧光标记，处死大鼠后取左侧胫骨中段不脱钙包埋制备骨标本，骨组织形态计量学分析骨量和骨结构变化情况。结果：静态参数显示：与C组相比，M组骨组织总面积明显变小、皮质骨面积百分比和皮质骨厚度显著降低，骨髓腔面积百分比明显增大；胫骨皮质上出现侵蚀小孔。动态参数显示：与C组相比，M组骨外膜面荧光标记周长百分比无显著变化，但骨矿化沉积率、骨形成率明显增加；骨内膜面荧光标记周长百分比、骨矿化沉积率明显提高，骨形成率和骨吸收周长百分数明显增加。结论：腺嘌呤作用下高磷饮食大鼠胫骨皮质骨的骨外膜、内膜的骨形成和吸收活跃；皮质骨内外膜骨量丢失，说明骨吸收大于骨形成、骨偶联失衡而导致皮质厚度减少，处于明显的骨高转化代谢状态。

肾性骨病模型腺嘌呤高磷饮食骨高转换皮质骨

骨根据组织形态不同可分为松质骨和皮质骨，其中松质骨骨密度较疏松，但富有弹性，其结构有助于维持骨骼形态，抵抗压力，主要分布于骨的内部；而皮质骨占全身骨骼重量的80%，主要位于长骨骨干、扁骨和不规则骨的表层，结构致密坚固，抗压抗扭曲性强。皮质骨和松质骨根据自身结构特点合理分布于骨组织，各自发挥着不同的作用，共同完成支撑和保护机体的重要功能。因此，在建立大鼠模型探讨骨代谢疾病机制、开展药物防治的研究中，应分别考虑松质骨和皮质骨的变化情况。

在不同生理病理状态下胫骨骨干皮质骨骨量和结构的变化一直是骨形态计量学研究的主要内容之一，也是反映机体骨代谢情况的重要指标[1]。本实验室与合作单位的前期研究探讨了大鼠肾性骨病(ROP)模型的造模方法，与正常对照组相比，所构建模型组大鼠的血清生化指标如血清肌酐、尿素氮、血磷、血钙、甲状旁腺激素及成纤维细胞生长因子23均显著增加；且肾脏组织切片检查结果表明其肾小球明显萎缩，近曲小管上皮细胞萎缩，近曲小管管腔扩大，并有炎细胞浸润，与人类的慢性肾功能衰竭肾脏病理学改变情况相似[2]。基于此模型，探讨ROP对大鼠松质骨的影响，结果发现ROP大鼠胫骨松质骨骨量丢失、骨结构破坏，骨吸收和骨形成都很活跃，且骨吸收大于骨形成，呈现出明显的骨高转化状态[3]。而皮质骨与松质骨存在结构及功能的差异，本研究着眼于ROP模型大鼠胫骨皮质骨，观察其骨量和骨结构变化、分析对骨代谢的影响，为揭示ROP的发病机制奠定基础。

材料与方法

药品腺嘌呤(C5H5N5，上海源聚生物科技有限公司)、钙黄绿素(C30H26N2O13,美国Sigma公司)。

实验动物及分组 3月龄雄性SPF级 SD大鼠24只，体重(250±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[质量合格证编号：SCXK(京)2012-0001]；分笼饲养于室温24～28 ℃，相对湿度50%～70%的清洁环境中，每日更换垫料，自由摄食和摄水。适应性喂养1周后，采用高磷(磷含量1.03%)联合腺嘌呤(腺嘌呤含量0.75%)饮食建立慢性肾脏病(CKD)模型：大鼠随机分为高磷饮食对照组(Control，C)和腺嘌呤模型组(Model，M)，每组12只，分组及给药情况如表1所示。

表1 分组及给药方案

实验饲料参照1993年美国营养学会的标准 (AIN-93G)[4]，根据实验需要调整钙磷比例；含腺嘌呤的高磷饲料，主要成分为腺嘌呤0.75%，钙1.11%，磷1.03%，酪蛋白9%；不含腺嘌呤的高磷饮食，主要成分为钙1.11%，磷1.03%，酪蛋白9%

大鼠在实验结束前第13、12、3、2天分别皮下注射钙黄绿素(10 mg/kg)进行体内荧光标记。

皮质骨标本硬包埋及制片实验结束时，大鼠经戊巴比妥钠麻醉后心脏取血、处死，迅速取出左侧胫骨，分离胫骨中段(TX)，进行固定、脱水、包埋[1]，包埋块以Leica SP1600型横式锯片机锯成45 μm厚的骨片，清洗、脱水并封片。

骨形态计量学测量本实验所有参数命名采用国际通用的标准骨组织形态计量学术语命名法之一的Dr. Frost and Jee 教授团队命名法[5]，经BIOQUANT OSTEO骨组织形态图像分析系统(BIOQUANT Image Analysis Corporation)测量获得二维参数，再通过公式计算得到的三维参数对骨量、骨结构、骨形成和骨吸收等进行评价分析。

统计学方法用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差表示，LSD-t检验法比较组间的变量差异，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为统计学差异显著。

结果

大鼠TX形态学静态参数变化情况与C组相比，M组胫骨骨组织总面积明显变小(P<0.01)(图1)；皮质骨面积百分比和皮质骨厚度显著降低(P<0.01)，骨髓腔面积百分比明显增大(P<0.01)(表2)；且M组胫骨骨内膜面出现明显的骨吸收表面，胫骨皮质上可见侵蚀孔；总体表现为骨量严重丢失、骨结构明显破坏。

图1 大鼠胫骨中段皮质骨切片(4 μm，×2)A：对照组；B：模型组

大鼠TX形态学动态参数变化情况如图2、表3所示：与C组相比，M组胫骨皮质骨的骨外膜面荧光标记周长百分数(%P-L.Pm)变化无显著差异、而骨矿化沉积率(P-MAR)、骨形成率(P-BFR/BS)明显增加(P<0.01)；骨内膜面荧光标记周长百分数(%E-L.Pm)、骨矿化沉积率(E-MAR)明显提高(P<0.05)、骨形成率(E-BFR/BS)和骨吸收周长百分数(%Er.Pm)明显增加(P<0.01)。表明M组大鼠皮质骨的骨形成和骨吸收都较C组活跃。

表2 大鼠胫骨中段皮质骨静态参数比较±s,n=12)

与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

表3 大鼠胫骨中段皮质骨动态参数比较±s,n=12)

与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

图2 大鼠胫骨中段皮质骨荧光照片(4 μm，×2)A：对照组；B：模型组

讨论

早在2000多年前，我国传统医学著作《内经》就以“肾主骨”理论概括肾与骨的关系，认为骨骼的发育、生长和代谢与肾之精气的盛衰密切相关，若人体肾精充足，则“骨内髓足而骨强”，否则“肾衰则形体疲极也”，现代医学研究不仅阐明了肾与骨联系的物质基础、证实了“肾主骨”理论的科学性，也指出ROP是“肾气衰弱”下的“骨失所养”——肾功能损害引起的各种病理因素协同作用而导致ROP的发生[6]。临床发现慢性肾功能衰竭患者几乎都面临着ROP的风险，因发病机制复杂，治疗有一定难度，严重影响透析患者的生存质量，近年来其防治研究越来越受重视。

大鼠骨代谢、解剖与人类相似度高，虽然存在如皮质骨无明显的骨单位重建、终身维持活跃的骨建造、重力承载方式与人类有差异等不足，但仍是骨代谢疾病防治研究中使用最多的动物。大鼠切除卵巢后表现出与女性绝经后骨丢失类似的情况[7]，在构建废用性骨质疏松或骨丢失模型中呈现与人类相似的低骨转换状态[8]；此外，也有诸多报道观察酒精、营养等因素对大鼠骨骼发育、生长的影响[9,10]；而Langer等的研究则证实通过口服腺嘌呤诱导大鼠慢性肾病-肾功能衰竭模型与人类慢性肾衰竭相似[11]。本实验室与北大医学院肾脏病研究所合作，采用腺嘌呤(饲料中含量0.75%)联合高磷(饲料中含量1.03%)饮食法成功建立了大鼠ROP模型[2]。

骨骼中有松质骨和皮质骨两种组织形态，它们的结构各有特点，分布于骨的不同部位，共同完成支撑、保护机体，调节钙磷平衡等重要功能。研究中应考虑同一因素对不同部位不同组织结构骨骼的影响可能有所不同，即应分别观察松质骨和皮质骨的变化，如在骨形态计量学研究中，常以胫骨骨干的皮质骨为研究对象，观察其在不同生理病理状态下的骨量和骨结构变化，不仅能反映机体的骨代谢情况，也是评价骨代谢疾病防治药物疗效的重要指标之一。

现有文献多关注ROP对松质骨的影响[11-13]，而对皮质骨变化的研究不足，本实验重点探讨ROP大鼠胫骨中段皮质骨的骨形态变化情况。研究结果表明，与只给予高磷饮食的大鼠相比，经4周腺嘌呤诱导的高磷饮食大鼠胫骨皮质骨总面积变小、皮质骨骨量减少、厚度明显变薄、骨髓腔变大，且皮质骨上出现大量侵蚀孔，使皮质骨的结构变弱。分别对骨外膜和骨内膜的动态参数进行分析：从骨外膜面测得研究数据来看，模型大鼠的骨形成率和骨矿化沉积率明显增加，表明其成骨细胞活性增加，虽然目前还无法直接测量骨吸收的变化，但鉴于皮质骨总面积明显减少，说明骨外膜面破骨细胞的骨吸收活性也是增加的，且增加程度大于骨形成的增加；而骨内膜测量结果表明模型大鼠骨形成率和骨吸收率都明显增加，因骨髓腔面积扩大，说明内膜面的骨吸收大于骨形成。即，无论是骨外膜还是骨内膜，胫骨皮质骨的骨形成和骨吸收都非常活跃，且骨吸收大于骨形成，属于高转换型骨量丢失。而我们此前的研究发现ROP模型大鼠松质骨的变化也符合高转换型骨病特征——骨量丢失、骨结构破坏，骨吸收和骨形成都很活跃，且骨吸收大于骨形成[3]，这说明此ROP建模对大鼠不同部位的骨骼均有影响，且对松质骨和皮质骨的影响机制一致。

如图1所示，ROP模型大鼠皮质骨切片上出现了明显的侵蚀小孔，这些小孔是由于破骨细胞异常活跃、将正常骨组织吸收侵蚀而形成，这种皮质骨大面积孔隙率的出现破坏皮质骨的结构、影响皮质骨的生物力学功能、增加骨折风险[14]。虽然大鼠皮质骨因没有哈佛氏系统(即骨单位)，不能体现人类皮质骨骨单位的变化情况，但这些出现在靠近骨内膜面皮质骨区域的侵蚀小孔，其形态和位置都与其他具有骨单位的哺乳动物在皮质骨骨丢失时的状况相似[15]，说明大鼠皮质骨在特殊诱因(如年龄、药物等)下会表现出类似人类皮质骨骨单位重建的现象，该模型可模拟人类ROP病程中皮质骨骨丢失和结构变化的情况。

小结：本研究探讨腺嘌呤诱导下高磷饮食大鼠皮质骨的变化，弥补了现有研究对皮质骨的重视不足，证实该模型大鼠皮质骨符合高转换型骨病的临床特征，为后续研究ROP防治提供了实验依据。

1 刘忠厚.骨矿与临床.北京：中国科学技术出版社,2006:513-515.

2 Meng Y,Zhang H,Li Y,et al.Effects of unfractionated heparin on renal osteodystrophy and vascular calcification in chronic kidney disease rats.Bone,2014,58:168-176.

3 张豪,孟彦,金小冬,等.高磷联合腺嘌呤饮食诱导大鼠高转化型肾性骨病模型的建立与分析.中国骨质疏松杂志,2014,20(5):485-489.

4 Reeves PG,Nielsen FH,Fahey GC Jr.AIN-93 purified diets for laboratory rodents:final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet.J Nutr,1993,123(11):1939-1951.

5 Jee WS.Harold M.Frost,M.D.,D.Sc.(hon)——one man′s association.J Musculoskelet Neuronal Interact,2006,6(2):113-121.

6 李小生,唐杨,王茂泓.“肾主骨”与肾性骨病理论探讨.江西中医药,2006,37(3):12-13.

7 Frost HM,Jee WS.On the rat model of human osteoporosis.Bone Miner,1992,18(3):227-236.

8 Lelovas PP,Xanthos TT,Thoma SE,et al.The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research.Comp Med,2008,58(5):424-430.

9 Seibel MJ.Molecular markers of bone turnover:biochemical,technical,and analytical aspects.Osteoporos Int,2000,11(Suppl 6):S18-S29.

10 Seto H,Aoki K,Kasugai S,et al.Trabecular bone turnover,bone marrow cell development,and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats.Bone,1999,25(6):687-695.

11 Langer S,Kokozidou M,Heiss C,et al.Chronic kidney disease aggravates arteriovenous fistula damage in rats.Kidney Int,2010,78(12):1312-1321.

12 Iwamoto J,Seki A,Sato Y,et al.Vitamin K(2) improves renal function and increases femoral bone strength in rats with renal insufficiency.Calcif Tissue Int,2012,90(1):50-59.

13 Ferrari GO,Ferreira JC,Cavallari RT,et al.Mineral bone disorder in chronic kidney disease:head-to-head comparison of the 5/6 nephrectomy and adenine models.BMC Nephrol,2014,15:69.

14 Hutchison AJ,Whitehouse RW,Boulton HF,et al.Correlation of bone histology with parathyroid hormone,vitamin D3,and radiology in end-stage renal disease.Kidney Int,1993,44(5):1071-1077.

15 Jee WS,Yao W.Overview:animal models of osteopenia and osteoporosis.J Musculoskelet Neuronal Interact,2001,1(3):193-207.

(本文编辑心平)

The cortical bone mass and structure in a mouse model of renal osteodystrophy

CHENJun1,MENGYan2,ZHONGYan1,ZHANGHao1,YANGGuozhu1,LUXingyan1,LIMin1,ZUOLi2,LIQingnan1

1SchoolofLifeScienceandBiopharmaceutics,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China2RenalDivision,PekingUniversityFirstHospital,Beijing,China;PekingUniversityInstituteofNephrology,Beijing,China;KeyLaboratoryofRenalDisease,MinistryofHealth,Beijing,China;KeyLaboratoryofChronicKidneyDiseasePreventionandTreatment(PekingUniversity),MinistryofEducation,Beijing100034,China

LIQingnan(E-mail:qingnanli@sina.com)

Objective：To observe the cortical bone changes in the renal osteodystrophy model by feeding an adenine and high phosphorus diet to rats, and discuss the effects of an adenine with high phosphorus diet on bone mineral metabolism. Methodology：Twenty four cases of male SD rats were randomly divided into control group (C group were fed on high phosphorus diet for all 6 weeks ) and model group (M group were fed an adenine and high phosphorus diet for 4 weeks followed a high phosphorus diet without adenine for 2 weeks). All rats were injected subcutaneously with calcein (10 mg/kg) at 13, 12, 3, and 2 days before sacrifice for fluorescent labeling. The left tibia shaft was taken for bone histomorphometry after uncalcified embedded. Results：Bone histomorphometry static parameters showed that total tissue area, percent cortical area and cortical width were significantly decreased in M group, while the percent marrow area was increased, comparing with those in C group. Erosion holes were found in cortical bone. Dynamic parameters displayed that no significant difference was founded in percent labeled perimeter while mineral apposition rate and bone formation rate were significantly increased in M group, compared with the C group on periosteum surface. While parameters on endosteum surface, such as percent labeled perimeter, mineral apposition rate, bone formation rate and percent eroded perimeter were significantly increased. Conclusion：The activation of bone formation and bone resorption on periosteum and endosteum surface were observed, and the reason for bone mass and thickness reduction involved the bone resorption rate is greater than bone formation rate. Cortical bone was obviously presented high bone turnover in rat feeding an adenine with high phosphorus diet. Erosion holes in cortical bone showed the destruction of bone structure.

model of renal osteopathy adenine high phosphorus diet high bone turnover cortical bone

1广东药学院生命科学与生物制药学院(广州，510006)；2北京大学第一医院肾内科北京大学肾脏病研究所教育部肾脏病重点实验室教育部慢性肾脏病的预防与治疗重点实验室

李青南(E-mail:qingnanli@sina.com)

2014-10-13