CYP17基因多态性与新疆维、汉民族女性乳腺癌相关性研究

李 静 郭 莉 李 妍 胡 欣 李红玉 杨顺娥

CYP17基因多态性与新疆维、汉民族女性乳腺癌相关性研究

李 静 郭 莉 李 妍 胡 欣 李红玉 杨顺娥

目的探讨CYP17 rs743572位点基因多态性在新疆维、汉民族女性乳腺癌中的分布与乳腺癌易感性的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测130例维吾尔族女性乳腺癌患者、125例维吾尔族正常女性及120例汉族女性乳腺癌患者、118例汉族正常女性的CYP17 rs743572位点多态性，并分析该位点多态性与新疆维、汉民族女性乳腺癌易感性的关系。结果在病例组及对照组中，维、汉两民族基因型分布及等位基因频率具有显著差异(P<0.05)；在维、汉族各亚组中，病例组与对照组的基因型分布差异及等位基因频率均无统计学差异(P>0.05)；维、汉两民族病例组与对照组各基因型及等位基因均未增加患乳腺癌的风险。结论病例组、对照组中维、汉两民族基因型分布及等位基因频率具有显著差异。CYP17基因rs743572位点多态性与新疆维、汉民族女性乳腺癌的发生无明显相关。

乳腺癌；CYP17基因；维吾尔族；汉族；基因多态性

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1588～1592)

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一[1]，其发生发展存在着显著的种族及地域的差异。日益增多的研究表明，乳腺癌相关基因的单核苷酸多态性为不同种族、不同人群乳腺癌发生差异的根本原因[2]。而由于乳腺癌为雌激素依赖性肿瘤，故与雌激素合成代谢相关的基因突变最有可能会改变雌激素的暴露情况，从而影响乳腺癌的发生发展。CYP17基因是参与雌激素合成代谢的关键酶，在其5'编码区存在着T→C的多态位点[3]，即rs743572多态位点，该多态性位点的存在影响了CYP17基因的转录，从而影响了体内雌激素的水平，故与乳腺癌的发生紧切相关。目前关于CYP17基因单核苷酸多态性与维吾尔族乳腺癌的相关性未见报道，本文通过病例-对照研究及Logistic回归分析，探讨了CYP17 rs743572位点基因多态性与新疆维、汉民族女性乳腺癌易感性之间的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

病例组需居住在新疆地区20年以上，经术后临床病理确诊为乳腺癌，排除既往有化放疗、内分泌治疗及肿瘤病史者，需除外合并严重脏器功能障碍、怀孕及哺乳期妇女。以体检健康女性为对照组。维、汉受试者家族中均无异族通婚史。其中，病例组为2013年1月到2014年9月就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院的130例维吾尔族及125例汉族初诊原发性乳腺癌的患者，对照组为三甲综合性医院体检正常的120例维吾尔族及118例汉族健康女性。结果显示，在维吾尔族中，病例组年龄为24～70岁，平均年龄为(45.35±9.33)岁，对照组年龄为24～66岁，平均年龄为(44.30±9.72)岁，两组的年龄分布差异无统计学意义(χ2=0.000，P>0.05)；汉族中，病例组年龄为25～73岁，平均年龄为(45.75±8.47)岁，对照组年龄为23～73岁，平均年龄为(44.95±8.44)岁，两组年龄分布亦无统计学差异(χ2=0.000，P>0.05)。以上研究对象为排除扩增失败的样本。本研究经新疆医科大学医学伦理委员会审核批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2 实验室检测

1.2.1 材料和试剂 血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)购自天根生化科技有限公司(北京)，引物使用NCBI网及引物设计软件Primer Premier 5设计，由北京奥科鼎盛生物公司合成。Msp I限制性内切酶(10 U/μl)购自Fermentas公司(加拿大)。

1.2.2 实验方法 抽取维、汉受试者清晨空腹外周静脉血2 mL，编号标记，裂解红细胞提取DNA，行对应片段PCR扩增、限制性内切酶酶切、通过电泳观察图谱来分析序列之间的差异。CYP17 rs743572位点位于5'启动子区，存在T-C多态位点。从Genebank中获取基因序列，引物使用NCBI网及引物设计软件Primer Premier 5设计，上游引物：5'-CAT TCG CAC TCT GGA GTC-3'；下游引物：5'-AGG CTC TTG GGG TAC TTG-3'，PCR产物419 bp，扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35次循环后72 ℃最终延伸7 min。PCR反应产物经过2%琼脂糖凝胶100V 恒定电压下电泳50 min分离，Marker所示条带由上至下分别为600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp共6条条带，当PCR产物CYP17在419 bp处出现特异性荧光条带，表示扩增成功。将扩增产物及酶切体系配好于0.2 ml PCR管内，37 ℃酶切12 h，经过3.5%琼脂糖凝胶80 V电压下电泳50 min。随机选取部分CYP17 rs743572基因片段基因型PCR扩增产物进行基因序列的测定。

1.3 统计学分析

应用 SPSS 17.0统计软件对所得数据进行分析，测得的基因型、等位基因频率与Hardy-Weinberg平衡的符合程度以及维、汉病例组与对照组之间等位基因与基因型频率的比较采用卡方检验(χ2检验)。应用非条件logistic回归分析计算优势比(odds ratio,OR)及其95%可信区间(confidence interval，CI)分析CYP17基因rs743572基因多态性与乳腺癌发病的相对危险度，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扩增DNA检测结果

采用紫外分光光度法，检测CYP17样本基因组DNA，结果显示，在493个样本中，平均浓度为567.20 ng/μL，平均吸光值为1.83。

2.2 PCR扩增电泳产物

CYP17 rs743572片段引物扩增后产物为419 bp，在Marker标记中，其位于500 bp和400 bp条带之间并接近400 bp，有特异性大小的片段产生。如显影不佳或未显影时需查找原因并重新进行检测，见图1。

M为Marker；1～7为PCR产物。

2.3 酶切结果

未被酶切开的长度419 bp的一条亮带为TT型，出现295 bp和124 bp两个条带的为CC型，出现419 bp、295 bp、124 bp 3个条带的为TC型，见图2。

M为Marker;1、2为TT纯合子;3、4为CC纯合子;5、6为TC杂合子。

2.4 PCR产物测序鉴定

随机选取的CYP17 3种基因型PCR扩增产物进行基因序列的测定结果如图显示，测序结果中碱基的改变与酶切结果一致，见图3。

A为TT基因型(74T);B为CC基因型(74C);C为TC基因型(74C/T)。

2.5 Hardy-Weinberg平衡检测

应用SPSS 17.0 软件进行CYP17各基因型 H-W 平衡的检测，结果显示，新疆维吾尔族及汉族的病例组和对照组的CYP17各基因型分布均符合H-W平衡定律，各P值分别为0.876、0.818、0.965、1.000，提示维、汉民族病例组和对照组基因型均符合遗传平衡定律，见表1、2。

2.6 基因型分布

维吾尔族主要为T等位基因携带者，而汉族以C等位基因携带者为主。在病例组及对照组中，不同基因型及等位基因频率在维、汉两民族中分布的差异均具有统计学意义，χ2值分别为15.864、15.457、9.083、9.201，P<0.05。但在维吾尔族及汉族组中，病例组与对照组基因型分布及等位基因分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3、4。

表1 维吾尔族病例组和对照组Hardy-Weinberg平衡检测(例，%)

表2 汉族病例组和对照组Hardy-Weinberg平衡检测(例，%)

表3 在病例组及对照组中维汉民族基因型分布及等位基因频率的比较(例，%)

表4 在维汉民族中各基因型分布及等位基因频率的比较(例，%)

2.7 CYP17基因型多态性与乳腺癌的危险性关系

Logistic 回归模型分析显示，以野生型TT基因型为对照，TC、CC或TC+CC基因型均与维吾尔族及汉族女性乳腺癌的发病风险无关(P>0.05)。而与等位基因T相比较，携带等位基因C亦与维吾尔族及汉族女性乳腺癌的发病风险无关(P>0.05)，见表5、6。

表5 CYP17各基因型及等位基因型与维吾尔族乳腺癌危险性的关系(例，%)

表6 CYP17各基因型及等位基因型与汉族乳腺癌危险性的关系(例，%)

3 讨论

近40年来亚洲女性的乳腺癌发病率呈逐年上升趋势[4]，新疆维吾尔族乳腺癌患病例数亦呈上升趋势，而内源性雌激素在乳腺癌的发生发展中起着重要的作用。雌激素参与乳腺癌的发生一方面是通过增加乳腺导管上皮细胞有丝分裂作为促癌因子；另一方面，雌激素代谢产物可与DNA结合，引起DNA损伤和直接导致基因突变作为癌变的启动因子发挥作用。CYP17是参与雌激素合成代谢的关键酶，位于人类染色体10q24.3区域，包括7个内含子和8个外显子，主要催化其它性激素和类固醇激素形成雄激素前体物质[5]，从而形成雌激素。

目前发现CYP17基因单核苷酸多态性位点主要为以下3处[3]：①在6内含子的5471碱基上存在着一个C→T的突变位点；②在其编码区5'上游的47碱基处存在G→A的突变位点；③在其5'编码区的34碱基处有一个T→C的突变位点，即rs743572多态位点，该单核苷酸多态性位点变异为限制性内切酶MspA I的酶切位点，此多态性位点的存在使得CYP17的5'翻译区出现了一个额外的CCACC启动子位点，改变了CYP17基因的转录，从而影响体内雌激素的水平，故此多态位点研究较多。

目前关于CYP17基因多态性与乳腺癌易感性的相关性研究未取得一致的结论。大部分研究证实C等位基因型与女性循环中高雌激素水平相关，并增加乳腺癌的发病风险[6]，但目前关于CYP17基因单核苷酸多态性与维吾尔族乳腺癌的易感性未见报道。维吾尔族乳腺癌较汉族乳腺癌有其自身的特点，如具有发病年龄小、妊娠次数多、月经初潮晚、绝经年龄小、哺乳时间长、肿瘤负荷大、腋窝淋巴结转移多、孕激素受体阳性率低、三阴性乳腺癌多[7]等特点。由此提示，遗传易感性及单核苷酸多态性可能是上述差异的潜在原因之一。Gibson等[8]报道发现亚洲的菲律宾人乳腺癌的患病率较亚洲其他地区人群高，这也进一步揭示了乳腺癌的发病是遗传与环境因素共同作用的结果。

本研究结果显示，维、汉两民族病例组及对照组基因型分布及等位基因频率具有显著差异(P<0.05)。维吾尔族含有高加索人种血统，其主要携带T等位基因，而汉族作为亚洲人种，其主要携带C等位基因，这与既往国内外研究结果一致。而本研究中，维吾尔族及汉族女性乳腺癌患者CC型基因频率分别15.4%、33.3%，这与美国(16%)、日本(26%)有所差异[9-10]，原因可能与地域环境、研究群体的选择、各种随机偏差和系统误差以及小样本量等因素有关。

此外，谢伟等[11]对中国汉族女性的相关研究显示，病例组突变基因型显著高于对照组(P<0.05)，且突变基因型增加了中国汉族女性的乳腺癌的发生风险。Anna等[12]对波兰罗兹地区高加索人的研究亦提示CC基因型及携带突变C等位基因可能增加乳腺癌的发生风险。然而王丽等[13]在一份大宗的Meta分析中指出，无论CYP17基因纯合突变还是杂合突变模型与女性乳腺癌的易感性均无关(P>0.05)，但该研究包含高加索人及汉族，没有具体分析不同民族之间的差异，故可能对Meta分析的结果有一定的影响。另一项针对高加索人种的大型荟萃分析[14]中，共纳入35项研究包括22 090例病例和28 498例对照进行汇总分析，亦无证据表明CYP17 MspA1多态性与乳腺癌的发生相关。本研究中比较了CYP17基因多态性与维、汉两民族乳腺癌的发病风险。其中，在维吾尔族组中，携带CYP17各基因型者均未显示出增加患乳腺癌的风险，这与Surekha等[15]对印度高加索人群的研究结果一致。在汉族人群中，携带CYP17各基因型亦未显示出增加汉族女性乳腺癌的发病风险，该结果与Yao等[16]对中国汉族人群该位点基因多态性与乳腺癌易感性的Meta分析中得出的结论一致。但本研究结果与大部分研究结果不一致，这可能是由于该基因的低外显性及样本量相对较小所导致的。

本研究仅对CYP17单个基因的单个位点的核苷酸多态性与乳腺癌易感性进行分析，尚不能确定是该位点本身或与其他位点多态性协同作用引起乳腺癌易感，因此，为了更加全面研究新疆维、汉女性乳腺癌的易感性，还需进一步研究新疆维、汉人群CYP17基因不同位点以及参与雌激素代谢的其它酶联合突变与乳腺癌易感性的关联的研究，同时还需再进行多中心、大样本及更多已知的乳腺癌危险因子的综合分析的研究，从而更好地服务于临床，更好地指导新疆维吾尔族乳腺癌的个体化诊断及治疗。

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(编辑：吴小红)

Correlation between CYP17 Gene Polymorphism and Breast Cancer of Uygur and Han Women in Xinjiang

LIJing,GUOLi,LIYan,etal.

Objective To investigate the relationship between CYP17 rs743572 gene polymorphism and breast cancer susceptivity in Uygur and Han women.Methods Using the polymerasechain reaction-restrictive fragment length polymorphism(PCR-RFLP)method to examine the CYP17 rs743572 position spot polymorphism from 130 cases of Uygur patients with breast cancer,125 cases of Uygur normal women,120 cases of Han patients with breast cancer,and 118 cases of Han normal women,and to analyze the relationship between polymorphism at this spot and susceptivity with breast cancer.Results In the 2 groups of the Uygur and Han,the genotype distribution and allele frequency had significant difference (P<0.05).There was no significant difference between genotype distribution and allele frequencies in both groups of the Uygur and Han (P>0.05);Genotype and allele didn't increase the risk of breast cancer for both groups of the Uygur and Han.Conclusion In the 2 groups of the Uigur and Han,the genotype distribution and allele frequency have significant difference.CYP17 rs743572 polymorphism is not related to breast cancer in both Uygur and Han groups.

Breast cancer；CYP17 gene；Uygur；Han；Gene polymorphism

新疆维吾尔自治区科技厅自然科学基金(2013211A068)

830011 新疆医科大学附属肿瘤医院

杨顺娥

10.3969/j.issn.1001-5930.2015.11.003

R737.9

A

1001-5930(2015)11-1588-05

2015-04-20

2015-06-25)

TheAffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi,830011