有氧训练对力竭运动大鼠线粒体通透性转运孔的影响

胡志刚，周 蕾，丁树哲

（1.江西师范大学体育学院，江西南昌330022；2.南昌工学院，江西南昌330108；3.华东师范大学体育与健康学院，上海200241）

运动人体科学

有氧训练对力竭运动大鼠线粒体通透性转运孔的影响

胡志刚1，周 蕾2，丁树哲3

（1.江西师范大学体育学院，江西南昌330022；2.南昌工学院，江西南昌330108；3.华东师范大学体育与健康学院，上海200241）

从肌细胞线粒体通透性转运孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的角度，探讨有氧训练抗运动疲劳的效应和机制。方法：24只SD大鼠随机分成对照组（D）、力竭运动组（L）和有氧训练组（T），每组8只，T组进行6周有氧训练后，将L组进行力竭游泳运动，记下至力竭时间，T组再进行同等时间的游泳运动，运动结束后即刻处死大鼠，并进行MPTP开放检测、线粒体膜电位检测及线粒体Ca2＋转运检测。结果：1）与D组相比，T组和L组MPTP开放检测吸光值显著性下降（P＜0.01）；与T组相比，L组MPTP开放检测吸光值显著性下降（P＜0.05）。2）与D组相比，T组和L组线粒体膜电位检测荧光值显著性升高（P＜0.01）；与T组相比，L组线粒体膜电位检测荧光值显著性升高（P＜0.05）。3）与D组相比，T组和L组线粒体Ca2＋转运检测吸光值显著升高（P＜0.05和P＜0.01）；与T组相比，L组线粒体Ca2＋转运检测吸光值显著升高（P＜0.05）。结论：力竭运动会引起MPTP的高通透性开放，造成线粒体膜电位降低，线粒体Ca2＋大量释放，而有氧训练可以显著性地降低MPTP的开放程度，减少线粒体膜电位和Ca2＋的丢失，从而减少线粒体的损伤。

有氧训练；力竭运动；线粒体通透性转运孔；膜电位；钙离子转运

线粒体通透性转运孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）低通透性开放在维持线粒体和细胞正常的生理功能方面起非常重要的作用。它参与细胞内钙稳态的调控及生理性钙振荡，同时可能防止线粒体钙超载；它还参与ATP／ADP的转运和能量代谢。但MPTP高通透性开放是一种病理性的不可逆开放，会造成线粒体膜电位降低、ATP衰竭、氧化磷酸化去偶联、线粒体大幅度肿胀、外膜破裂、内外膜间促凋亡因子的释放等，从而细胞发生凋亡或坏死［1］。剧烈的运动会导致机体活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的生成急剧增加，不及时清除就会导致ROS的堆积。高浓度的ROS是一种有效的MPTP诱导剂［2－3］，它会导致MPTP的高通透性开放。此外，在ROS及其他机械或代谢等各方面的影响下，会导致运动时Ca2＋的转运失去平衡，细胞浆中高浓度的Ca2＋导致线粒体大量摄取Ca2＋，使得线粒体Ca2＋超载，引起Ca2＋诱导的线粒体Ca2＋释放现象（Ca2＋－induced release of Ca2＋from mitochondria，mCICR），使得MPTP开放［4］。而有氧训练可显著提高机体的有氧代谢水平，增进有氧工作能力，并提高机体线粒体基质酶及呼吸链酶活性，降低糖酵解酶活性，减少线粒体的氧化损伤，降低线粒体DNA缺失突变率，使线粒体产生适应性变化，提高氧化磷酸化功能［5］。通过观察力竭运动后疲劳状态下MPTP的变化，以及有氧训练对MPTP的积极影响，进一步揭示运动疲劳的机制及预防。

1 材料和方法

1.1 材料

HEPES，D－甘露醇，牛血清蛋白，α－硫辛酸（LA），罗丹明123，偶氮砷为Sigma公司产品，Bradford试剂盒由上海朝瑞生物科技有限公司提供，实验用SD大鼠购自江西医学院，严格按动物实验规定饲养。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组和训练方案 健康雄性SD大鼠24只，体重（221±14）g，随即分成对照组、力竭运动组和有氧训练组，每组8只。对照组和力竭运动组正常饲养，仅有氧训练组进行无负重游泳训练，每周训练6 d，每天1次，共6周，第一、二周每次训练45 min，第三、四周增加为每次训练60 min，最后两周每次训练90 min。有规律的有氧训练可以延长大鼠运动至力竭的时间［6］，因此，6周训练结束后，力竭运动组大鼠进行力竭游泳运动，记下至力竭时间，有氧训练组再进行同等时间的游泳运动，运动结束后即刻处死大鼠。食用饲料按60 g／800 g体重供给［7－9］。

1.2.2 线粒体的提取 所有大鼠断脊椎处死后，迅速取出股四头肌，剪碎置于10倍线粒体分离介质中（225 mmol／L甘露醇、75 mmol／L蔗糖和20 mmol／L Hepes，0.5 mmol／L EGTA和1%牛血清白蛋白（p H7.2））用匀浆机匀浆（除非注明，实验均于冰水浴中操作）。匀浆液于4℃，800 g离心10 min，除去细胞碎片及细胞核，取上清进一步以10 000 g离心10 min，所得沉淀即为线粒体。线粒体蛋白含量用Bradford检测试剂盒进行检测，得到的线粒体按12 mg／ml蛋白浓度用MPTP测试介质悬浮并置冰上保存，使用前用MPTP测试介质稀释至0.3 mg／ml蛋白浓度。MPTP测试介质含230 mmol／L甘露醇、70 mmol／L蔗糖和3 mmol／L Hepes（p H7.4）。

1.2.3 MPTP开放检测 MPTP开放引起的线粒体内膜对甘露醇和蔗糖高通透性造成线粒体膨胀，表现为线粒体光密度（optical density）减少。因而可通过测定光密度值变化反映MPTP开放。参照Petronilli等［10］方法，石英杯中加入3 ml MPTP测试介质，然后根据线粒体的蛋白浓度加入一定量的线粒体，用紫外分光光度计检测540 nm处的吸光值，检测温度为20℃。

1.2.4 线粒体膜电位检测 线粒体膜电位（ΔΨm）敏感探针罗丹明123（Rh123）由于ΔΨm电负性储积在线粒体内，MPTP开放会引起ΔΨm的崩溃［11］，导致储积在线粒体内的Rh123释放出来，使得荧光强度升高。因此，检测测试体系内Rh123的荧光变化可反映ΔΨm的变化。参照Emaus等［12］的方法，EP管中加入3 ml MPTP测试介质，然后分别加入一定量的线粒体和Rh123（终浓度为30 nmol／L），37℃避光染色45 min，然后在荧光光度计上检测Rh123的荧光强度值，激发波长—发射波长：488 nm～525 nm，测试温度为20℃。

1.2.5 线粒体Ca2＋转运检测 偶氮砷Ⅲ（AⅢ）是一种Ca2＋指示剂，具有灵敏度高，对Ca2＋选择性强，膜不通透等特点，可灵敏地反映Ca2＋的连续变化［13］。参照Frei等［14］方法，EP管中加入一定量的线粒体和3ml MPTP测试介质，然后分别加入50 μmol／L AⅢ作为Ca2＋指示剂，室温避光染色45 min，在双光束紫外分光光度计上检测675～685处的吸光值，测试温度为20℃。测试系统内的Ca2＋浓度降低和升高表明线粒体摄取和外排Ca2＋，从而反映线粒体Ca2＋转运。

1.3 统计学分析

实验数据用Excel和SPSS 13.0进行处理和统计学分析，采用单因素方差分析对组间差异进行比较。

2 实验结果

2.1 MPTP开放检测结果

由表1可以看出，与对照组相比，有氧训练组和力竭运动组MPTP开放检测吸光值显著性下降P＜0.01；与有氧训练组相比，力竭运动组MPTP开放检测吸光值显著性下降P＜0.05。

表1 各组大鼠MPTP开放检测吸光值

2.2 线粒体膜电位检测结果

由表2可以看出，与对照组相比，有氧训练组和力竭运动组线粒体膜电位检测荧光值显著性升高P＜0.01；与有氧训练组相比，力竭运动组线粒体膜电位检测荧光值显著性升高P＜0.05。

表2 各组大鼠线粒体膜电位检测荧光值

2.3 线粒体Ca2＋转运检测结果

由表3可以看出，与对照组相比，有氧训练组线粒体Ca2＋转运检测吸光值显著升高P＜0.05；与对照组相比，力竭运动组线粒体Ca2＋转运检测吸光值显著升高P＜0.01；与有氧训练组相比，力竭运动组线粒体Ca2＋转运检测吸光值显著升高P＜0.05。

表3 各组大鼠线粒体Ca2＋转运检测吸光值

3 讨论

MPTP是线粒体膜上的一种通道，Zam zamin等［7］报道MPTP至少由胞质的己糖激酶（hexokinase－1）、外膜的外周苯二氮卓受体（peripheral benzodia－zepine receptor，PBR）、电压依赖性阴离子通道（voltage－ependent anion channel，VDAC）、肌酸激酶、内膜的腺苷酸转运蛋白（adenine nucleotide translocator，ANT）及基质的亲环素D（cyclophilin D）组成［15］。但目前公认的观点是VDAC与ANT是MPTP的必要和主要组成部分［16］。MPTP受到多种因素的调控，Ca2＋、NAD（P）＋、ROS等能促使转运孔的开放，而Mg2＋、小于7的p H值环境以及环孢菌素A（Ciclosporin A，CsA）等能抑制转运孔的开放［2－3］。

力竭运动对线粒体产生损伤并削弱线粒体的功能，线粒体在短时间内结构功能下降，MPTP膜通透性发生改变，造成线粒体膜电位降低、ATP衰竭、氧化磷酸化去偶联、线粒体大幅度肿胀、外膜破裂、内外膜间促凋亡因子的释放等，从而细胞发生凋亡或坏死［1］，而线粒体的这一系列变化，也是引起运动疲劳的主要因素［17］。力竭运动导致MPTP膜通透性改变的机制尚不清楚，但在ROS及其他机械或代谢等各方面的影响下，会引起mCICR现象，从而导致MPTP开放，并且高浓度的ROS本身就是一种有效的MPTP诱导剂。有氧训练可以提高机体有氧代谢能力，提高有氧代谢酶的活性，加快ROS的清除速度，对线粒体的结构和功能也能产生积极的效应，亦可在一定程度上对MPTP的通透性产生积极的影响。

从实验结果可以看出，力竭运动组和有氧训练组与对照组相比，MPTP开放检测吸光值显著性下降，表明MPTP不再处于生理性的低通透性开放，而是处于或接近于不可逆的高通透性的开放，引起了线粒体本身的膨胀反应。有氧训练组和力竭运动组进行了同样时间的游泳运动，而有氧训练组MPTP开放检测吸光值要显著高于力竭运动组，也即表明有氧训练组MPTP的开放程度要显著性低于力竭运动组。线粒体膜电位和线粒体Ca2＋转运能够进一步反映MPTP的变化情况。与对照组相比，有氧训练组和力竭运动组线粒体膜电位检测荧光值显著性升高，荧光值升高反映的是MPTP开放引起ΔΨm的崩溃，说明有氧训练组和力竭运动组MPTP都处于开放状态，但是有氧训练组膜电位的变化要显著低于力竭运动组的变化，从而反映的是有氧训练组MPTP的开放程度要显著性低于力竭运动组，而通过线粒体Ca2＋转运检测情况能够进一步确定这一结果。与对照组相比，有氧训练组和力竭运动组线粒体Ca2＋转运检测吸光值均显著升高，吸光值升高反映MPTP开放引起线粒体释放Ca2＋，但是有氧训练组Ca2＋转运检测荧光值要显著低于力竭运动组。三项检测指标的结果出现高度一致，故推测力竭运动会引起MPTP的高通透性开放；有氧训练组大鼠显然并未力竭，但也会引起MPTP不同程度的开放；有氧训练组在经过系统的有氧训练后，进行力竭运动组同等强度的运动，对比未训练的力竭运动组，MPTP开放程度明显降低，有效地抑制了MPTP的开放程度。

MPTP高通透性的开放是结构功能下降的消极反应。潘华山等人的研究也发现，运动疲劳组线粒体结构与周围组织分界不清，基膜缺损，线粒体数较少，嵴嵴破坏溶解改变、消失明显，嵴上颗粒减少或消失，肌丝杂乱、溶解，无明显完整的肌节结构，持续运动对骨骼肌线粒体产生了损伤［18］。付玉等人的研究也发现，从线粒体呼吸链逸出形成的活性氧导致线粒体膜通透性升高，线粒体跨膜电位降低，ATP合成减少，持续的活性氧氧化作用使线粒体DNA损伤增多，导致线粒体结构功能严重受损，促进细胞衰老甚至死亡［5］。这都与本文研究结果高度一致。在力竭运动中，不论MPTP的高通透性开放是机械摩擦的刺激引起还是代谢产物活性氧引起，都会造成线粒体的损伤，降低运动能力。而有氧训练可以提高有氧代谢能力，减少线粒体的损伤，降低MPTP的开放程度，使之更趋近于生理性的开放状态，加强物质代谢的转运和能量代谢，而非病理性的高通透性状态。有氧训练的这种积极作用，可能是通过提高线粒体相关酶活性、降低线粒体DNA缺失突变率、使线粒体产生适应性变化、提高氧化磷酸化功能来实现的［5］。

4 结论

实验结果提示，力竭运动会引起MPTP的高通透性开放，造成线粒体膜电位降低，线粒体Ca2＋大量释放，而有氧训练可以显著性地降低MPTP的开放程度，减少线粒体膜电位和Ca2＋的丢失，从而减少线粒体的损伤。

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责任编辑：郭长寿

Effects of Aerobic Training to Exhaustive Exercise Rat Mitochondrial Permeability Transition Pore

HU Zhigang1，ZHOU Lei2，DING Shuzhe3
（1.Jiangxi Normal University，Nanchang 330022，Jiangxi，China；2.Nanchang Institute of Science and Technology，Nanchang 330108，Jiangxi，China；3.East China Normal University，Shanghai 200241，China）

From the mitochondria permeability transition pore perspective，we study effect and mechanism of aerobic training on sports fatigue.Methods：24 SD rats were randomly divided into control group（D），exhaustive exercise group（L）and aerobic training group（T），8 rats in each group，T group for 6 weeks of aerobic training，group Lperformed exhaustive swimming exercise time to exhaustion，note，T group again the same time swimming exercise，the rats were sacrificed immediately after exercise and MPTP open detection，detection of mitochondrial membrane potential and mitochondrial Ca2＋translocation detection.Results：（1）compared with Dgroup，T group and Lgroup MPTP open detection light absorption value decreased significantly（P＜0.01）；compared with Tgroup，L group，MPTP open detection light absorption value decreased significantly（P＜0.05）.（2）compared with D，T group and L group，the mitochondrial membrane potential measured fluorescence values increased significantly（P＜0.01）；compared with Tgroup，L group of mitochondrial membrane potential detection fluorescence values increased significantly（P＜0.05）.（3）compared with Dgroup，T group and Lgroup of mitochondrial Ca2＋transport detection light absorption values significantly increased（P＜0.05 and P＜0.01）；compared with Tgroup，L group of mitochondrial Ca2＋transport detection light absorption value was significantly increased（P＜0.05）.Conclusion：exhaustive exercise can cause MPTP high permeability open，resulting in decreased mitochondrial membrane potential，mitochondrial Ca2＋release，whereas aerobic training can significantly reduce the degree of openness of MPTP，reduce the loss of mitochondrial membrane potential and Ca2＋，thereby reducing the mitochondrial damage.

aerobic exercise；exhaustive exercise；mitochondria permeability transition pore；membrane potential；calcium ion transport

G804.7

A

1004－0560（2015）03－0064－04

2015－02－12；

2015－03－09

胡志刚（1984—），男，讲师，硕士，主要研究方向为机能评定、运动疲劳的恢复与机制。