止咳枇杷颗粒微生物限度检查方法验证

郭秀秀

安徽省宿州市食品药品检验所，安徽 宿州 234000

止咳枇杷颗粒微生物限度检查方法验证

郭秀秀

安徽省宿州市食品药品检验所，安徽 宿州 234000

目的：止咳枇杷颗粒的微生物限度检查的方法验证。方法：按 《中国药典》2010年版附录微生物限度检查法规定的方法进行验证试验。结果：大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌以常规法验证回收率均大于70%。结论：止咳枇杷颗粒的细菌、霉菌和酵母菌的计数方法可采用常规法，控制菌可采用常规法检验。

止咳枇杷颗粒；微生物限度检验法；方法验证

止咳枇杷颗粒是一种常用中成药，具有清肺、止咳、化痰的作用，用于咳嗽多痰。处方由枇杷叶、白前、桔梗、桑白皮、百部、薄荷脑六味中药组成，其中桔梗、百部、薄荷脑均具有一定的抑菌作用［1］。《中国药典》2010版附录Ⅻ－ⅠC微生物限度检验方法中规定，建立药品的微生物限度检验方法必须进行方法验证，确证供试液制备、测定方法及检测系统适用于该药品的检验，保证微生物限度检验方法的科学性和检验结果的准确性。本文参照2010年版 《中国药典》［2］、《中国药品检验标准操作规范》［3］进行试验，对止咳枇杷颗粒的微生物限度检验方法进行方法验证，结果表明细菌、霉菌及酵母菌计数可采用常规法、控制菌检查可采用常规法。

1 试验环境与材料

1.1 试验环境 根据2010年版《中国药典》规定，试验在环境洁净度10000级、局部洁净度100级的单向流空气的无菌室进行，阳性菌操作在符合国家Ⅱ级生物安全标准的生物安全柜内进行。

1.2 实验仪器 BHC－1300ⅡA2型生物安全柜（苏州苏净仪器自控设备有限公司）；GHP－9162型电热恒温培养箱（上海金慧科电子有限公司）；MJX－160B－Z型微电脑霉菌培养箱 （上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；DYXDHS型隔水式电热恒温培养箱 （上海跃进医疗器械厂）；YXQ－LS－75SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器（上海市博讯实业有限公司医疗设备厂）；TZQ－Ⅱ型匀质器型号 （天津市津德实验仪器技术开发中心）。

1.3 供试品 止咳枇杷颗粒（批号：20140429、20140501、20140502，安徽省雪枫药业有限公司）。

1.4 验证菌种 大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44 102］、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63 501］、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26 003］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98 001］均由中国医学菌种保藏中心提供，黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98 003］由中国药品生物制品检定所提供，试验用菌株的传代次数为3代。

1.5 培养基 营养琼脂培养基（批号：121130）、玫瑰红钠琼培养基 （批号：110811）、营养肉汤培养基 （批号：110406）、改良马丁培养基（批号：130227）、曙红亚甲蓝琼脂培养氧基（EMB，批号：1110102）、胆盐乳糖培养基（批号：1111162）、4－甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG，批号：1110102）均由北京三药科技开发公司提供。

根据2010年版《中国药典》附录Ⅻ－ⅠC的规定，计数培养基符合计数培养基适用性检查的要求；控制菌检查用培养基符合促生长、指示和抑制能力的要求。

1.6 稀释剂 0.9%无菌氯化钠溶液（蚌埠丰原涂山试剂有限公司）；pH7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液 （杭州微生物试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 菌悬液的制备 枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌在营养肉汤培养基中33℃培养24h，各取1ml培养物用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至10－5、10－7、10－7，备用；白色念珠菌在改良马丁液体培养基中经25℃培养24h，取培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至10－5，备用；黑曲霉在改良马丁斜面培养基中经25℃培养1周，用5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉孢子，吸取经无菌棉花过滤的孢子菌悬液1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至10－6，备用。

2.2 菌悬液中含菌量检验 取“2.1”中枯草芽孢杆菌10－5级稀释液1m l放入已灭菌的平皿中，用45℃无菌营养琼脂培养基20ml注皿且平行测定两皿，33℃培养48h计数；取10－7级金黄色葡萄球菌、10－7级大肠埃希菌分别注皿培养，方法及培养条件同枯草芽孢杆菌。取 “2.1”中白色念珠菌10－5级稀释液1ml放入已灭菌的平皿中，用45℃玫瑰红钠琼脂培养基20ml注皿，平行测定两皿，25℃培养5d逐日观察计数；取10－6级黑曲霉孢子菌悬液1ml注皿培养，方法及培养条件同白色念珠菌。

所有患者均接受MSCT诊断，采用128排螺旋CT机进行扫描，仪器型号为西门子SIEMENS128层AS+，相关参数设置：层厚0.625mm，转速0.35s/周，电压120kV，自动毫安（480～680mA），重建野及显示野25cm，标准算法，扫描野Large，重建层厚0.625mm，间隔0mm，从器官隆突处向下扫描至心脏膈面。在PR间期R波后75%R-R间期时相实施重建选取质量较佳的对象做最后观察分析，采用碘普罗胺作为对比剂，规格为370mgI/mL，采用双筒高压注射器Stellan Medrad，对比剂总量0.9mL/kg，采用30～40mL生理盐水，注速5mL/s。

根据2010年版 《中国药典》规定，细菌、霉菌和酵母菌方法验证所用菌悬液含菌量应为50～100 cfu／m l；控制菌方法验证所用菌悬液含菌量为10～100 cfu／ml。结果见表1，符合要求。

表1 菌悬液中含菌量 ／cfu／ml

2.3 供试液制备 取本品最小包装两袋（10g／袋），按微生物限度检查法规定称取10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100m l，匀浆仪2000转／min，3min混匀，即为1∶10的供试品溶液。

2.4 细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证

2.4.1 常规法 按照2010年版《中国药典》规定需进行3次独立的平行试验，且每次每种菌种需平行2皿。

2.4.2 试验组 取1∶10供试液1m l，枯草芽孢杆菌10－5级菌悬液1m l，注入无菌平皿，立即倾注45℃无菌营养琼脂培养基20m l，待凝固后置33℃阳性细菌培养箱中倒置培养24～72h，逐日观察结果并记录。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌同枯草芽孢杆菌。取1∶10供试液1m l，白色念珠菌10－5级菌悬液1m l，注入无菌平皿，立即倾注45℃无菌玫瑰红钠培养基20m l，待凝固后置25℃阳性霉菌培养箱中倒置培养5d，逐日观察结果并记录。黑曲霉同白色念珠菌。

2.4.3 菌液组 取枯草芽孢杆菌10－5级、金黄色葡萄球菌10－7级、大肠埃希菌10－7级菌悬液各1ml，分别注入平皿，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后置33℃细菌阳性培养箱中培养24～72h，逐日观察结果并记录。取白色念珠菌10－5级和黑曲霉10－6级菌悬液各1ml，分别注入平皿，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后置25℃霉菌阳性培养箱中培养5d，逐日观察结果并记录。

2.4.4 供试品对照组 取1∶10供试液1m l，注入平皿，立即倾注45℃无菌营养琼脂培养基或45℃无菌玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后营养琼脂培养基置阴性细菌培养箱中33℃培养24～72h，玫瑰红钠琼脂培养基置阴性霉菌培养箱中25℃培养5d，逐日观察结果并记录。

2.4.5 稀释剂对照组 取0.9%无菌氯化钠溶液1m l，枯草芽孢杆菌10－5级1m l，注入平皿，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后置33℃细菌阳性培养箱中培养24～72h，逐日观察结果并记录；金黄色葡萄球菌10－7级、大肠埃希菌10－7级方法同枯草芽孢杆菌。取0.9%无菌氯化钠溶液1m l，白色念珠菌10－5级1m l，分别注入平皿，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后置25℃阳性霉菌培养箱中培养5d，逐日观察结果并记录。黑曲霉10－6级菌悬液方同白色念珠菌。

2.4.6 实验结果 从表2可知，3次平行试验枯草芽孢杆菌、大肠埃细菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的试验组和稀释剂对照组的回收率均大于70%，根据 《中国药典》2010版规定，可以采用常规法测定供试品中细菌、霉菌和酵母菌数。

表2 细菌、霉菌和酵母菌常规法计数方法的验证结果 ／cfu

2.5 控制菌 （大肠埃希菌）检查方法验证

2.5.1 常规法 按照2010年版《中国药典》规定需进行3次独立的平行试验，且每次每种菌种需平行2皿

2.5.2 试验组 取已灭菌的装有100m l胆盐乳糖培养基的三角瓶一瓶，用无菌移液枪加入1∶10供试液10m l，10－7级大肠埃希菌菌悬液10m l，置35℃阳性培养箱中培养24h，按大肠埃希菌的检查法检查。

2.5.3 阴性对照组 取已灭菌的装有100m l胆盐乳糖培养基的三角瓶一瓶，用无菌移液枪加入0.9%无菌氯化钠溶液10m l，置35℃阴性培养箱中培养24h，按大肠埃细菌的检查法检查。

2.5.4 阳性对照组 取已灭菌的装有100m l胆盐乳糖培养基的三角瓶一瓶，用无菌移液枪加入10－7级大肠埃希菌菌悬液10m l，置35℃阳性培养箱中培养24h，按大肠埃希菌的检查法检查。

2.5.5 供试品组 取已灭菌的装有100m l胆盐乳糖培养基的三角瓶一瓶，用无菌移液枪加入1∶10供试液10m l，置35℃阳性培养箱中培养24h，按大肠埃希菌的检查法检查。

2.5.6 阴性菌对照组 阴性对照菌采用10－7级金黄色葡萄球菌，方法同试验组。

2.5.7 实验结果 由表3可知，大肠埃希菌阳性组、试验组生长良好，说明止咳枇杷颗粒对大肠埃希菌无抑菌作用或抑菌作用较弱，可以采用常规法检查。

3 结果与讨论

3.1 上述验证结果 止咳枇杷颗粒采用常规法测定细菌、霉菌及酵母菌的试验组和稀释剂对照组回收率均大于70%，说明可以采用常规法对细菌、霉菌、酵母菌及控制菌中大肠埃希菌进行检验且采用0.9%无菌氯化钠溶液作为稀释剂对试验不产生影响。

表3 大肠埃细菌方法验证实验结果

3.2 方法验证中阳性菌会造成环境污染 必须严格按照2010年版 《中国药典》附录中方法验证的规定，在无菌室的生物安全柜内操作，做好防护措施。同时供试品组及阴性对照组应在符合规定的洁净室内操作。

3.3 方法验证需进行三次独立的平行实验 为使结果获得良好的重现性，所加的培养基体积应尽量一致，培养基与所加试液应充分混合均匀。

3.4 菌落计数 菌落计数是方法验证实验过程中极为重要的一步，因此计数时应仔观察，必要时可借助放大镜等工具，排除药渣和小气泡的干扰，减少操作误差。

［1］南京中医药大学.中药大辞典 ［M］.上海：上海科学技术出版社，2006：833－5553.

［2］国家药典委员会编.中华人民共和国药典 （一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：107－116.

［3］中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范［S］.北京：中国医药科技出版社.2010：351－369.

Research on the determ ination of Validation method for m icrobial lim its test of Pibazhike Granule

GUO Xiuxiu
Anhui Suzhou Institute for Food and Drug Control，Suzhou 234000，China

ObjectiveTo establishmicrobial limit test for Pibazhike Granule.Methods Themethodswere according to Chinese Pharmacopoeia 2010 Edition Appendixmicrobial limit testmethod.Rusults The recoverieswere over70%when routinemethod was used with escherichia coli，bacillus subtilis，aspergillusniger，candida albicans，staphylococcusaureus.Conclusion It is effective and feasible thatbacteria，filamentons fungiand yeast countwere detected with routinemethod；Control bacteria can be tested by using the conventionalmethod.

Pibazhike Granule；microbial limits test；method validation

R921.2

A

1007－8517（2015）13－0008－02

2015.04.02）