八宝惊风散质量标准研究

隆颖栗建明孙丽丽王洪皓乔莉▲

1.广东省食品药品检验所，广州510180；2.广州市药品检验所，广州510160

八宝惊风散质量标准研究

隆颖1栗建明2孙丽丽1王洪皓1乔莉1▲

1.广东省食品药品检验所，广州510180；2.广州市药品检验所，广州510160

目的完善八宝惊风散的质量标准。方法采用显微鉴别对钩藤、防风、栀子进行定性鉴别，采用薄层色谱法对黄芩、冰片、人工牛黄、栀子进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对八宝惊风散中的天麻素进行含量测定。结果显微特征专属性强，薄层色谱斑点显色清晰，阴性无干扰，专属性强。天麻素在0.0252～5.0400μg检测范围内呈良好的线性关系，r=0.9996，平均回收率为97.4%，RSD为0.5%（n=6）。结论建立的分析方法简便可行，专属性强，可用于八宝惊风散的质量控制。

八宝惊风散；质量标准；显微鉴别；薄层色谱；高效液相色谱

八宝惊风散由天麻、天竺黄、钩藤、人工牛黄、栀子、珍珠、沉香、冰片、防风等19味药材组成，具有祛风化痰、退热镇惊的功效，用于小儿惊风，发热咳嗽，呕吐痰涎等症状[1]。原质量标准为部颁标准（中药成方制剂）第20册，标准编号：WS3-B-3742-98，原标准包括性状项、显微鉴别（川贝母、茯苓、黄芩、珍珠）、2个理化鉴别、丁香的薄层鉴别和检查项，显然，原有标准不能很好地控制质量，为此，笔者参考相关文献[2-20]对其质量标准重新进行研究，新增加钩藤、防风、栀子的显微鉴别和黄芩、冰片、人工牛黄及栀子的薄层鉴别，同时建立八宝惊风散中天麻素含量的测定方法，以更全面有效地控制本品质量。

1 仪器与试药

Olympus BX41-32P02奥林巴斯显微镜，Waters 2695-2487、Agilent 1100高效液相色谱仪，Sartorius-CP224S电子天平，昆山KQ-300DA超声波清洗仪，薄层硅胶G薄层板（Merck预制板）。

黄芩苷对照品（批号：110715-200805）；黄芩对照药材（批号：120955-200607）；冰片对照品（批号：110743-200303）；胆酸对照品（批号：100078-200414）；栀子苷对照品（批号：110749-200512）；天麻素对照品（批号110807-200205）均由中国药品生物制品检定所提供。1005010、1006012、0604006由广东联康药业有限公司提供；100517由江西民济药业有限公司提供，阴性对照由广东联康药业有限公司提供。试剂：乙腈为德国默克MERCK色谱纯，水为液相色谱用超纯水；其他为分析纯。

2 方法与结果

2.1 显微特征鉴别[3-5]

取本品，置显微镜下观察：草酸钙砂晶存在于薄壁细胞中，有时含晶细胞连接成行（钩藤）。油管含金黄色分泌物，直径17～60μm（防风）。种皮石细胞颜色多为黄色或淡棕色，表面现为长多角形或方形，也有部分形状不规则，细胞壁稍厚，层纹明显，多为圆形，胞腔内含棕红色物（栀子）（图1）。

图1 显微鉴别图

2.2 薄层色谱鉴别

2.2.1 黄芩的薄层色谱鉴别[6-8]

称取样品约5 g，用50ml甲醇回流提取60 min，提取液滤过，置水浴上蒸干，残渣加20ml实验用水，微热使溶解，放冷至室温，加石油醚Ⅱ（60～90℃）30ml振摇提取，弃去石油醚Ⅱ提取液，分取下层水液，用盐酸调节溶液的pH值至2，再加乙酸乙酯振摇提取两次（30、30ml），合并乙酸乙酯提取液，置水浴上蒸干，残渣用1ml甲醇溶解，制成供试品溶液。另称取黄芩对照药材约0.15 g，按上述供试品溶液的提取方法制成黄芩对照药材溶液。称取黄芩苷对照品约2mg，加入1ml甲醇溶解，制成黄芩苷对照品溶液。称取黄芩阴性样品约5 g，按上述供试品溶液的提取方法同法制成黄芩阴性对照溶液。按照中国药典一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取黄芩苷对照品溶液2μl，黄芩供试品溶液和黄芩阴性对照溶液各1μl、黄芩对照药材溶液1μl，点状点样于同一Merck硅胶G预制板上，展开剂为乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（7∶3∶1∶1），置展开缸中预饱和30min后展开，取出薄层板，挥干展开剂，喷以显色剂（1%三氯化铁乙醇溶液）。结果显示，试品溶液色谱中，在与黄芩苷对照品和黄芩对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的色谱斑点，且黄芩阴性对照在相应位置上无干扰（图2）。

图2 黄芩薄层色谱鉴别图

2.2.2 冰片的薄层色谱鉴别[9-12]

取本品4.6 g，加石油醚（60～90℃）25ml，置超声波清洗仪中超声提取15min，提取液滤过，滤渣备用，滤液挥至约0.5ml，即得。称取冰片对照品约3mg，加1ml乙酸乙酯溶解作为冰片对照品溶液。称取冰片阴性样品4.6 g，按上述供试品溶液的提取方法，同法制成冰片阴性对照溶液。按照中国药典一部附录ⅥB薄层色谱法试验，分别吸取冰片供试品溶液、冰片对照品溶液和冰片阴性对照溶液3μl，点状点样于同一Merck硅胶G预制板上，展开剂为环己烷-乙酸乙酯（9∶1），置展开缸中展开，取出薄层板，挥干展开剂，喷以显色剂（5%香草醛硫酸溶液）后，将薄层板在110℃加热5～10min。结果显示，供试品溶液色谱中，在与冰片对照品色谱斑点相应的位置上，显两个相同颜色的色谱斑点，冰片阴性对照在相应位置上无干扰（图3）。

图3 冰片薄层色谱鉴别图

2.2.3 人工牛黄的薄层色谱鉴别[2，13-14]

称取胆酸对照品约2mg，加1ml甲醇溶解制成胆酸对照品溶液。另称取人工牛黄阴性样品约5 g，按上述2.2.1黄芩供试品溶液的提取方法，制成人工牛黄阴性对照溶液。按照中国药典一部附录ⅥB薄层色谱法试验，分别吸取2.2.1黄芩鉴别项下的供试品溶液、人工牛黄阴性对照溶液和胆酸对照品溶液各3μl，点状点样于同一Merck硅胶G预制板上，展开剂为正己烷-乙酸乙酯-36%乙酸-甲醇（20∶25∶2∶3）的上层溶液，置展开缸中展开，取出薄层板，挥干展开剂，喷以显色剂（10%硫酸乙醇溶液）后，薄层板置105℃加热至斑点颜色清晰。结果显示，供试品溶液色谱中，在与胆酸对照品色谱斑点相应的位置上，显相同颜色的色谱斑点，人工牛黄阴性对照在相应位置上无干扰（图4）。

图4 人工牛黄薄层色谱鉴别图

2.2.4 栀子的薄层色谱鉴别[15-16]

取2.2.2冰片鉴别项下的滤渣，加入30ml甲醇，置超声波清洗仪中超声提取20 min，提取液滤过，置水浴上蒸干，残渣加20 ml实验用水，置水浴上微热使溶解，加入30 m l正丁醇（水饱和）振摇提取，正丁醇提取液置水浴上蒸干，残渣加1m l甲醇溶解，再加入1 g中性氧化铝（100～200目），在水浴上搅拌均匀，加在中性氧化铝柱（100～200目，柱内径为1 cm，2 g）上，加40%甲醇50 ml于中性氧化铝柱中进行洗脱，收集40%甲醇洗脱液，置水浴上蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制成供试品溶液。另称取栀子苷对照品约2mg，加1m l甲醇溶解，制成栀子苷对照品溶液。称取栀子阴性样品约4.6 g，按上述供试品溶液的提取方法，制成栀子阴性对照溶液。按照中国药典一部附录ⅥB薄层色谱法试验，分别吸取栀子供试品溶液、栀子阴性对照溶液和栀子苷对照品溶液各5μl，点状点样于同一Merck硅胶G预制薄层板上，展开剂为二氯甲烷-甲醇（4∶1），置展开缸中展开，取出薄层板，挥干展开剂，喷以显色剂（10%硫酸乙醇溶液）后，薄层板置105℃加热至斑点颜色清晰。结果显示，供试品溶液色谱中，在与栀子苷对照品色谱斑点相应的位置上，显相同颜色的色谱斑点，栀子阴性对照在相应位置上无干扰（图5）。

图5 栀子薄层色谱鉴别图

2.3 天麻素的含量测定[2，17-20]

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Analytical C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；以乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）为流动相；检测波长为220 nm。进样体积为20μl。

2.3.2 溶液的制备

2.3.2.1 天麻素对照品溶液的制备称取天麻素对照品0.01008 g，置20ml容量瓶中，加流动相溶解，并稀释至刻度，制成天麻素对照品储备液（0.504 mg/ml）。精密吸取天麻素对照品储备液2 ml，置50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，制成天麻素对照品溶液（20.16μg/ml）。

2.3.2.2 样品溶液的制备取样品混匀，取约2 g，精密称定，置于100 ml具塞锥形瓶中，再精密加入50 ml稀乙醇溶液，密塞，并称定重量，置超声波清洗仪内超声提取（功率为300W，频率为45 kHz）60 min，取出锥形瓶，放冷至室温，再称定锥形瓶重量，用稀乙醇补足超声过程中损失的重量，将溶液摇匀，滤过。再精密吸取上述续滤液10m l，置于水浴上蒸至近干，残渣用流动相溶解并转移至10m l容量瓶中，加流动相定容至刻度，即得。

2.3.2.3 天麻阴性对照溶液的制备取广东联康药业有限公司提供天麻阴性对照2 g，同2.3.2.2样品溶液的制备方法制备天麻阴性对照溶液。

2.3.3 专属性试验

取上述样品溶液、天麻素对照品溶液及天麻阴性对照溶液，按2.3.1色谱条件进样，记录色谱图，结果天麻阴性对照溶液在天麻素对照品保留时间相同的位置上未见色谱峰，表明天麻阴性对照无干扰，方法专属性良好（图6）。

图6 天麻素液相色谱图

2.3.4 线性关系

取天麻素对照品适量，精密称定，加流动相制成对照品储备液（0.504mg/ml）。再分别精密吸取适量，加稀乙醇制成系列天麻素对照品溶液。精密吸取上述系列天麻素对照品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪测定，以天麻素对照品进样量（X）为横坐标，对应峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得线性方程Y= 1769844X－12541；r=0.9996。表明天麻素对照品在0.0252～5.0400μg检测范围内，进样量与对应的峰面积具良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验

取同一天麻素对照品溶液（浓度为20.16μg/ml），连续测定6次，记录天麻素色谱峰面积，计算平均峰面积的RSD=0.3%，表明所用仪器的精密度良好。

2.3.6 重复性试验

取同一批八宝惊风散样品混匀，称取约2 g，平行称取6份，精密称定，按照2.3.2.2样品溶液的制备方法制备样品溶液，进样，测定，用外标法计算样品中天麻素的含量，结果天麻素含量为0.370 mg/g，RSD= 0.9%（n=6），表明拟定实验方法的重复性良好。

2.3.7 稳定性试验

取同一批样品，按2.3.2.2样品溶液的制备方法制备样品溶液，在室温放置，分别在0、1、4、6、12、24 h进样，测定，结果天麻素的平均峰面积的RSD=1.6%（n=6），表明样品溶液在室温下24 h内稳定。

2.3.8 回收率试验

取同一批样品混匀，精密称定样品约1 g，平行称取6份样品，置于100ml具塞锥形瓶中，精密加入天麻素对照品适量，按2.3.2.2样品溶液的制备方法制备溶液，计算天麻素的回收率，结果见表1。由表1可知，天麻素平均回收率为97.4%，RSD为0.5%，说明方法的准确度较好。

表1 回收率试验结果

2.3.9 样品测定

取4批样品，按2.3.2.2样品溶液的制备方法制备溶液，测定天麻素的含量，结果批号为1005010、1006012、0604006、100517的样品中天麻素的含量分别为0.45、0.44、0.37、0.11mg/g。

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

参照2010年版《中国药典》一部天麻[2]项下的含量测定方法，采用C18键合硅胶为填料的反相色谱柱。同时考察本品在使用不同色谱柱测定的情况下，天麻素含量测定结果受影响的程度。分别采用Hypersil ODSC18、Analytical C18、Kromasil C18三种品牌的色谱柱测定。结果显示，用三种品牌的色谱柱测定，结果无明显差异，表明拟定方法耐用性好。

3.2 检测波长的选择

中国药典2010年版一部天麻项下的检测波长为220 nm，实验过程中采用紫外-可见分光光度计在200～400 nm波长范围内进行扫描，结果在220、270 nm波长处均有最大吸收，在220 nm波长处的灵敏度远远高于270 nm波长，故首选220 nm作为测定波长。

3.3 提取方法的选择

试验研究过程中考察了不同的提取溶剂（甲醇、稀乙醇、水）和提取方法（加热回流、超声），结果表明采用稀乙醇超声提取，操作简便，提取效率高且提取杂质少；考查了不同体积的提取溶剂（25、50、100 m l）和不同的超声时间（30、60、90 min）对提取效率的影响，结果表明50 ml稀乙醇提取效果好且色谱的响应值适中；不同超声提取时间效果相差不大，最终确定文中的供试品提取方法。方法学考察结果表明，所建立的方法简便，专属性强、重现性好，可作为八宝惊风散的质量控制。

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Study on quality standard of Babao Jingfeng powder

LONG Ying1LIJian-ming2SUN Li-li1WANG Hong-hao1QIAO Li1▲
1.Institute of Food and Drug Control of Guangdong Province,Guangzhou 510180,China;2.Institute of Drug Control of Guangzhou City,Guangzhou 510160,China

Objective To perfect the quality standard of Babao Jingfeng powder.M ethods Themicroscopic characteristics of Uncaria tomentosa,Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.,Gardenia jasminoides Elliss were developed bymicroscope.Scutellaria baicalensis,Borneolum Syntheticum,Bovis Calculus Artifactus,Gardenia jasminoides Elliss were identified by TLC.The content of gastrodin in Babao Jingfeng powder was determined by HPLC.Results The microscopic characteristics were exclusive.TLC spots were clear and well-separated without interference from negative sample.The linear range of gastrodin was 0.0252-5.0400μg(r=0.9996)and the average recovery rate was 97.4%,RSD=0.5%(n=6). Conclusion Themethod is simple and highly accurate.It can be used for the quality control of Babao Jingfeng powder．

Babao Jingfeng powder;Quality standard;Microscopical identification;TLC;HPLC

R931.5

A

1674-4721（2015）04（c）-0017-05

2015-01-20本文编辑：李亚聪）

国家药品标准提高研究课题（99）

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