中药对去势小鼠生殖系统及行为学的影响

★ 郭文宇 刘灿灿 董艺丹 张小旭 张秀文 孙凤芹 王逸舒 夏雷（山东中医药大学 济南 250355）

中药对去势小鼠生殖系统及行为学的影响

★ 郭文宇 刘灿灿 董艺丹 张小旭 张秀文 孙凤芹 王逸舒 夏雷*（山东中医药大学 济南 250355）

目的：观察中药熟地、丹参对去势小鼠子宫及行为学的影响，评价其对更年期综合征的干预作用。方法：将40只昆明种雌性小鼠随机分为正常组、模型组、熟地组、丹参组，每组10只,除正常组外，其余各组行双侧卵巢切除术模拟雌激素缺乏引起的更年期综合征。通过强迫游泳实验观察中药对去势小鼠行为学的影响，通过子宫系数、病理形态学观察及免疫组化法观察中药对去势小鼠子宫发育的影响。结果：与正常组相比，模型组子宫系数、内膜厚度及血管密度明显减少（P<0.05）。熟地组、丹参组可改善子宫系数及内膜厚度，其中熟地组内膜间质增生较明显，丹参组血管增生较明显，具有统计学意义（P<0.05）。结论：熟地、丹参具有类雌激素样作用。去势小鼠可较好的模拟更年期综合征的临床表现，熟地、丹参对其症状具有一定的缓解作用，但其机制可能不同。其中，对子宫内膜的影响熟地可促进内膜间质细胞生长，丹参可诱导血管的生成。

熟地；丹参；更年期综合征

更年期综合征（climacteric syndrome,CS）是指更年期妇女因卵巢功能逐渐衰退或丧失，以至雌激素水平下降所引起的机体内分泌失调、免疫功能低下和自主神经功能紊乱的症候群。传统的激素替代疗法（hormone replacement therapy，HRT）可缓解或治疗更年期综合征，但长期应用有可能诱发乳腺癌、子宫内膜癌等。因此，人们开始寻找雌激素的替代物。其中植物雌激素的生理效果是较为注目的研究焦点[1]。中医药对该病的治疗早已有之，其中又以活血化瘀药和补益药占有较大比例。本实验旨在通过观察熟地、丹参对去势小鼠子宫及行为学的影响，初步探讨雌激素缺乏与更年期综合征发生的关系，并观察中药在治疗更年期综合征中的作用机制和效果，为临床合理用药提供实验依据。

1 材料、仪器与试剂

1.1 动物 健康成年雌性昆明种小白鼠40只,体重20～38g，实验动物及饲料由鲁抗生物科技有限公司提供，合格证号：scxk鲁20130001。适应性饲养3d后开始实验。

1.2 仪器 分析天平（上海精密科学仪器有限公司，JA5003N）；电热干燥箱（中国重庆实验设备厂，CS101-1DS）；切片机（上海徕卡公司，RM2015）；恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）；显微镜（美国AO公司）。

1.3 试剂与药物 水合氯醛（国家集团化学试剂有限公司，T20080911）；青霉素（山东鲁抗医药股份有限公司，B131206）；熟地、丹参（山东中医药大学中鲁医院提供）；CD34免疫组化盒（博士德生物工程有限公司，09C12B）。

2 方法

2.1 动物分组及模型制作 将小鼠随机分为4组，每组10只，分别为正常组、模型组、熟地组、丹参组。除正常组外，其余各组行双侧卵巢切除术。小鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉，俯卧固定，于最末肋骨下、腋中线上约距脊柱2cm处剪毛，用酒精常规消毒局部皮肤，切开皮肤和背肌，可见一乳白色发亮脂肪团（卵巢包埋其中），以小镊子轻夹脂肪团拉出切口外，分离脂肪团后，可见到粉红色的卵巢，摘取卵巢；术后将子宫角送回腹腔，缝合肌肉和皮肤。同法摘取另一侧卵巢。术后第5d逐只进行阴道涂片检查，观察各组小鼠阴道脱落细胞角化指数（CD）的变化，每日1次，连续5次。以不出现动情期反应为造模成功[2]。

2.2 熟地、丹参水煎浓缩液制备及给药方式 取熟地、丹参各100g，分别加水800mL，浸泡30min，煎煮30min,过滤。药渣加水400mL,煎煮20min,过滤。合并两次煎液,浓缩至100mL,所得熟地、丹参水煎浓缩液的浓度为1g/mL,放入4℃冰箱中贮存,备用。熟地组和丹参组小鼠分别进行灌胃给药。正常组和模型组灌胃生理盐水。灌胃给药前将水煎浓缩液温热。每只每天灌胃0.1mL,连续灌胃21d。

2.3 强迫游泳 给药1周后,对各组小鼠进行强迫游泳,将小鼠置于25cm玻璃缸,水深15cm,水温20℃左右,每次1只。连续观察6min,记录后4min内累计不动时间（即漂浮水面、停止挣扎、仅仰头呼吸,或偶尔扑动上肢以保持平衡）[3]。每天1次,连续14天。取最后两次不动时间进行统计。

2.4 小鼠处死及子宫分离 末次给药24h后,小鼠头颈部位脱臼处死动物,电子天平称量体重。立即分离子宫，剔除子宫表面脂肪等杂物,分析天平称量子宫湿重,放入4%甲醛水溶液中固定。计算子宫系数（即：子宫湿重/体重×100%）。小鼠子宫经固定后,用常规梯度乙醇脱水,经二甲苯透明后,用65℃低熔点石蜡包埋。切片机切片,制备石蜡切片,切片厚度为4～5μm。常规二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化后,使用苏木素、伊红染色,中性树脂封片,镜下观察并拍照。

2.5 免疫组化及毛细血管密度检测 将子宫切片置电热干燥箱中30m in,控制温度60℃。常规脱蜡至水,抗原热修复,消除过氧化物酶活性,BSA封闭,滴加CD34抗体（一抗）、生物素标记二抗、酶标链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液,D A B显色,苏木素复染,中性树脂封片,镜下观察并拍照。以细胞质膜呈棕黄色为阳性。用Image-plus6.0分析软件进行分析,测定阳性反应产物的平均光密度值及新生毛细血管情况。计数方法:每张切片在显微镜下随机选取4个高倍视野，计算4个视野内毛细血管平均数。毛细血管判断标准为：染成棕黄色的数个内皮细胞围成的窦状、条索状管腔或无管腔结构的数个或单个内皮细胞[4]。

3 结果与分析

3.1 子宫系数 与正常组相比,模型组子宫系数明显降低。与模型组相比，熟地组和丹参组子宫系数升高，但无统计学意义，见表1。

表1 各组小鼠子宫系数(±s)

表1 各组小鼠子宫系数(±s)

注：与正常组比较,⋆P＜0.05。

组别 n 子宫重量/ g 子宫系数/ %正常组模型组熟地组丹参组9 8 9 7 0 . 0 5 7 ± 0 . 0 2 3 0 . 0 2 2 ± 0 . 0 1 7*0 . 0 2 6 ± 0 . 0 2 5 0 . 0 2 6 ± 0 . 0 2 1 2 . 0 4 ± 0 . 6 4 0 . 6 9 ± 0 . 4 9 0 . 8 6 ± 0 . 9 0 1 . 0 4 ± 0 . 8 4

3.2 强迫游泳与正常组相比,模型组小鼠不动时间明显延长。熟地组、丹参组与模型组相比，不动时间略微缩短,但仍比正常组要长,见表2。

表2 各组小鼠毛细血管密度及强迫游泳结果(±s)

表2 各组小鼠毛细血管密度及强迫游泳结果(±s)

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别正常组模型组熟地组丹参组n 9 8 9 7毛细血管密度/ m m2不动时间/ s 1 9 6 . 4 5 ± 2 1 . 3 0 9 7 . 2 2 ± 2 6 . 5 0 1 0 2 . 1 4 ± 3 1 . 2 3 1 5 2 . 4 0 ± 2 5 . 3 1△3 9 . 5 9 ± 3 8 . 1 1 5 2 . 4 8 ± 4 0 . 2 4 7 . 8 5 ± 4 0 . 2 1 4 8 . 5 6 ± 3 9 . 6 3

3.3 HE染色 正常子宫内膜：子宫内膜增生良好,子宫内膜腺上皮细胞与间质发育同步，腺上皮细胞呈低柱状,局部可见假复层排列,可见微绒毛,有核下空泡出现,细胞核呈空泡状,腺腔轻度扩张,可见粉红色分泌物；间质轻度水肿，部分标本呈蜕膜化改变,部分标本仍呈增殖期改变,可见血管扩张;子宫肌层发育良好,见图1-A。

模型组子宫内膜：子宫内膜发育不良,内膜及肌层与正常组相比明显变薄腺上皮细胞呈立方型,细胞核深染,染色质浓集,无明显空泡性变化,腺腔无明显扩张,无明显分泌物,间质无明显水肿、疏松改变，血管数量较少,无明显扩张,见图1-B。

熟地组子宫内膜：子宫内膜厚度正常，但与正常组相比，腺体数量明显减少，腺上皮细胞呈立方型及低柱状排列，可见少量空泡化改变，腺腔无明显扩张，无明显分泌物，间质增生较明显，间质疏松，可见轻度水肿，血管数量增加，并伴有明显扩张；肌层无明显萎缩，见图1-C。

丹参组子宫内膜：子宫内膜发育正常，腺体数量与模型组相比明显增多，腺上皮细胞呈低柱状，腺腔无明显扩张，可见少量粉红色分泌物，部分间质呈蜕膜化改变、疏松、水肿，内膜及肌层血管数量较丰富，可见明显扩张，见图1-D。

3.3 免疫组化 免疫组化显示，与正常组相比，模型组子宫内膜血管内皮细胞表达明显减少。与模型组相比，熟地组子宫内膜血管有少量增生，丹参组内膜增生较明显，但仍低于正常组，见表2、图2A-D。

4 讨论

图1 -A正常对照组

图1 -B模型组

图1 -C熟地组

图1 -D丹参组

更年期综合征是妇女的常见病和多发病,现已成为严重影响中老年妇女生活质量的主要疾患之一。中医学认为,其主要病机是肾虚；西医学认为，其核心病机是卵巢功能衰退，雌激素水平下降。中、西医在病因病机上的认识是统一的。激素替代疗法（HRT）是西医防治更年期综合征的主要方法。但同时带来了不良后果，如子宫内膜增生、生殖系统肿瘤、乳腺癌等[5,6]。近来发现，植物雌激素对更年期综合征有一定治疗和预防作用，且不良反应少。目前，对植物雌激素的研究和开发利用是医学研究的热点之一。

熟地为治疗妇科病的良药。古人云：“大黄附子为药中良将，人参熟地为药中良相。”如妇人良方“四物汤”中即重用熟地以治疗妇人血虚之头晕乏力、心悸怔仲、失眠、月经失调、崩漏等症。

丹参具有活血通经、凉血消肿、祛痈肿丹毒之功效。现代药理研究发现，丹参对冠心病、肝炎、肝硬化等疾病的治疗效果显著。同时，在治疗妇科疾病方面，丹参也有重要作用。早在五代时期，《日华子本草》明确指出，丹参可“安生胎，落死胎，止血崩、带下，调妇人经脉不匀”。至明朝，随着“一味丹参散，功同四物汤”的广泛流传，丹参遂成为妇科圣药，在妇科、产科得到广泛应用[7]。

图2 -A正常组

图2 -B模型组

图2 -C熟地组

图2 -D丹参组

本实验选用卵巢摘除小鼠（又称去势小鼠）模型来模拟CS。因为女性雌激素90%由卵巢分泌,摘除卵巢,切断其来源,人为地造成雌激素突然降低的环境,可模拟CS。此模型比较经典,造模时间短,模型成功率高[3]。

使用子宫增重法检测药物的雌激素活性是常用的评价雌激素作用的方法之一。实验结果显示：模型组子宫系数明显减少，高剂量熟地、丹参组子宫系数与模型组相比虽然有增加，但增加不明显（P>0.05），且与正常组相比仍然降低，说明熟地、丹参虽然具有一定的类雌激素样作用，但其活性较弱；可对更年期综合征产生一定的干预作用。通过病理形态学观察及免疫组化法观察，可知其作用机制有所不同：熟地在诱导子宫增生中的作用主要是促进间质细胞及血管的生长，对腺体生长的诱导作用较弱；而丹参不仅仅是诱导子宫间质及血管生长，对腺体的发育也有明显的促进作用。中药药效的发挥都是通过有效成分实现的。丹参的活性成分包括丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅲ、紫参酮甲素等，具有类雌激素样作用。但目前对熟地的研究较少，熟地的类雌激素样作用是通过哪种或哪些有效成分实现的，仍需进一步探索。从中医药的角度，熟地以补血为主，丹参以活血为主。本实验显示，熟地、丹参均可促进子宫内膜及肌层血管生长，其中丹参在促进血管生长方面的作用更明显。究竟其差异在活血、止血中药中普遍存在，还是由于两种药物中类雌激素成分不同引起的，也需要我们进一步去研究。

本实验通过强迫游泳实验来观察两味中药对去势小鼠行为学的影响。强迫游泳实验目前在抑郁症的研究中被广泛使用，不动时间越长，越具有绝望状态，能有效、定量地判定抑郁程度。本实验结果显示，模型组与正常组相比，不动时间延长，但缺乏统计学意义。这种结果可能是由于小鼠个体差异较大所引起的，也可能是由于雌激素缺乏。虽然雌激素缺乏可以影响到精神状态，但抑郁症的发生还受其他因素影响，单纯雌激素缺乏并不必然导致抑郁症的发生。雌激素缺乏与抑郁症发生的关系还需进一步探讨。熟地、丹参可减少不动时间，提示在治疗更年期心理异常，如更年期出现的情感障碍、情绪低落等方面可以发挥作用。

［1］Li Hong-Fang,Duan Ying,Wang Long-De,et al.Effects of estrogen and phytoestrogens on endometrial leakage in ovariectomized rats and the related mechanisms[J].Acta Physiologica Sinica,2013,65（1）:8-18.

［2］孙艳红,金若敏.女性更年期综合征动物模型制备的研究进展[J].时珍国医国药,2005,16（7）:657.

［3］徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].第三版.北京:人民卫生出版社,2002:808.

［4］张萍,刘志涛,何国祥,等.兔缺血心肌组织PTEN及VEGF的表达和血管生成关系的研究[J].解放军医学杂志,2010,35（8）:929-932.

［5］马吉祥,李会庆.植物雌激素与肿瘤[J].国外医学·肿瘤学分册, 2001,28（6）:416.

［6］张炎,胡娅莉.植物雌激素与激素替代治疗的比较[J].国外医学·妇幼保健分册,2005,16（4）:222.

［7］张亮亮.丹参功效考[J].江西中医学院学报,2012,24（2）:10-14.

［8］张海蓉.保产无忧散对产前抑郁模型小鼠的抗抑郁作用[J].中国实验方剂学杂志，2011,17（17）：194-196.

Effect of Chinese M edicine on the Reproductive System and the Behavior of Castrated Rats

GUO Wen-yu,LIU Can-can,DONG Yi-dan,ZHANG Xiao-xu,ZHANG Xiu-wen,SUN Feng-qin,WANG Yi-shu,XIA Lei
Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China.

Objective:To observe effects of Radix Rehmanniae Preparata and Salvia on the uterus and behavior of ovariectomized rats to evaluate interventional the effects on Climacteric Syndrome.Methods:Forty Kunming female rats were randomly divided into normal group,model group,Radix Rehmanniae Preparata group and Salviae group,with 10 rats in each group.Bilateral oophorectomy was performed to simulate Climacteric Syndrome induced.Through the forced swimming test to observe the effect of castration on behaviors ofmice,Pathomorphological observation and immunohistochemicalmethod to ovserve the effect of traditional Chinesemedicine on ovariectomized mice uterus.Result:Compared with the normal group,the uterus coefficient,the endometrial thickness and the endometrial vascular density decreased significantly in themodel group（P<0.05）.It is indicated that themodelwas built successfully. The uterus coefficient and the endometrial thickness were improved in the Radix Rehmanniae Preparata group and the Salviae group. In Radix Rehmanniae Preparata group,endometrial stromal hyperplasia was obvious,while in Salviae group,endometrial Vessels hyperplasia was obvious and statistical significance was obtained（P<0.05）.Compared with the normal group,immobility time was prolonged in themodel group and was improved in the Radix Rehmanniae Preparata group and the Salviae group.However,all of them had no statistical significance.Conclusion:Radix Rehmanniae Preparata and Salvia have estrogen-like activities.The ovariectomized mice can simulate Clinical Manifestation of Climacteric Syndrome quite well.Radix Rehmanniae Preparata and Salvia can relieve clinical symptom of Climacteric Syndrome,however theirmechanismsmay be different.Radix Rehmanniae Preparata can promote the growth of endometrial stromal cells,while Salvia can induce the growth of endometrial Vessels.

Radix Rehmanniae Preparata;Salvia;Climacteric Syndrome

R285.5

A

2014-06-23）编辑：万崇毅

*通信作者：夏雷。