单因素配伍剂量对经方芍药甘草汤药效组分的影响

朱广伟，张贵君，王晶娟，毛 莹，汪 萌

·药学研究·

单因素配伍剂量对经方芍药甘草汤药效组分的影响

朱广伟，张贵君*，王晶娟，毛 莹，汪 萌

目的 研究中药经方芍药甘草汤中炙甘草或醋白芍单因素配伍剂量变化对其药效组分的影响，为临床合理用药和建立中药药效组分质量评价标准提供科学依据。方法 以单因素配伍剂量的醋白芍和炙甘草为载体，以经方芍药甘草汤作为对照，按照汤剂制备供试品溶液，采用HPLC-DAD法，三波长同时测定药效组分氧化芍药苷-芍药内酯苷-芍药苷-苯甲酰芍药苷-甘草酸(λ=230 nm)、甘草苷-甘草素(λ=276 nm)、异甘草苷-异甘草素(λ=360 nm)的含量。结果 醋白芍剂量12 g不变时，其药效组分氧化芍药苷-芍药内酯苷-芍药苷-苯甲酰芍药苷的含量随炙甘草的剂量变化如下(mg/mL，n=3)：炙甘草12 g，醋白芍组分含量为1.90-0.89-3.45-0.53；炙甘草为1、6、9、15、18 g时，醋白芍组分含量均降低。炙甘草剂量12 g不变时，其药效组分甘草酸-甘草苷-甘草素-异甘草苷-异甘草素的含量随醋白芍的剂量变化如下(mg/mL，n=3)：醋白芍12 g，炙甘草的组分含量为9.06-3.19-0.76-0.77-0.15；醋白芍为1、6、9、15、18 g时，炙甘草组分含量均降低。结论 ①炙甘草或醋白芍配伍剂量变化时，其药效组分的溶出率与经方比较有显著差异，表明改变中药的配伍剂量其功效会产生变化；②醋白芍-炙甘草剂量比越接近1∶1，其相应的药效组分溶出率越高；③醋白芍的4种药效组分总含量随炙甘草配伍剂量变化规律：炙甘草12 g>9 g>15 g>6 g>18 g>3 g>1 g，药效组分总量为6.77～4.15 mg/mL；④炙甘草的5种药效组分总含量随醋白芍配伍剂量变化规律：醋白芍12 g>9 g>15 g>6 g>18 g>3 g>1 g，药效组分总量为13.93～10.34 mg/mL；⑤炙甘草剂量对芍药甘草汤药效组分总量的影响大于醋白芍。

芍药甘草汤；药效组分；配伍剂量；单因素

0 引言

芍药甘草汤最早见于汉代张仲景《伤寒论·辨太阳病脉证并治》第29条，有柔肝舒筋、缓急止痛之功效，是历代传承常用中药。古代医家对芍药甘草汤的研究较多，药味或有增减，功效亦各有异同，如：《伤寒论》方：醋白芍、炙甘草12 g∶12 g，止痛；《朱氏集验方》：生白芍、生甘草12 g∶8 g，主治消渴；《朱氏集验方》：赤芍、生甘草12 g∶2 g，治脚弱无力；《医门八法》方：生白芍、生甘草12 g∶4 g，治胃气痛；《魏氏家藏方》：生白芍、炙甘草12 g∶1 g，治湿热脚气。

历代芍药甘草汤配伍组分、配伍比例不同，其药用功能也不同，其根源在于药效组分的差异，配伍决定了药效组分，而药效组分最终决定了药用功能。本研究在中药药效组分理论的指导下[1-5]，以单因素配伍剂量的醋白芍和炙甘草为载体，以经方芍药甘草汤作为对照，按照汤剂制备供试品溶液，采用HPLC-DAD法，三波长同时测定药效组分氧化芍药苷-芍药内酯苷-芍药苷-苯甲酰芍药苷-甘草酸(λ=230 nm)、甘草苷-甘草素(λ=276 nm)、异甘草苷-异甘草素(λ=360 nm)的含量，研究中药经方芍药甘草汤中炙甘草或醋白芍单因素配伍剂量变化对其药效组分的影响，旨在揭示配伍剂量与药效组分的对应性关系，为临床合理用药和建立中药药效组分质量评价标准提供科学依据。

1 材料

Agilent 1260高效液相色谱仪，HP真空脱气泵，HP四元泵，HP自动进样，HP柱温箱，HP DAD检测器；WRX-1S型BP110S电子分析天平；Agilent Extend-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

氧化芍药苷(含量≥98%，批号：130317)、芍药内酯苷(含量≥98%，批号：130518)、芍药苷(含量≥98%，批号：130815)、苯甲酰芍药苷(含量≥98%，批号：131227)、甘草酸(含量≥98%，批号：121201)、甘草苷(含量≥98%，批号：131029)、甘草素(含量≥98%，批号：121102)、异甘草苷(含量≥98%，批号：130110)、异甘草素(含量≥98%，批号：131020)，均购自成都普菲德生物技术有限公司。醋白芍、炙甘草购自河北省安国路路通中药饮片有限公司，经北京中医药大学中药学院中药鉴定系张贵君教授鉴定分别为毛莨科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根、豆科甘草属植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎。供试品配伍比例及来源见表1。

表1 供试品配伍及来源(g)

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取9种对照品适量，分别加甲醇配制成含甘草苷1.02 mg/mL、异甘草苷1.03 mg/mL、甘草素1.12 mg/mL、异甘草素1.03 mg/mL、甘草酸1.10 mg/mL、芍药苷1.06 mg/mL、氧化芍药苷1.05 mg/mL、苯甲酰芍药苷1.18 mg/mL、芍药内酯苷1.17 mg/mL的单一对照品溶液。

依次精密量取以上8种对照品溶液(甘草酸除外)2.5、1、1、0.1、4.5、1、1、1.5 mL置同一25 mL容量瓶中，再加入11.01 mg的甘草酸对照品，加甲醇稀释至刻度，配制成含甘草苷102 μg/mL、异甘草苷41.2 μg/mL、甘草素44.8 μg/mL、异甘草素4.12 μg/mL、甘草酸440 μg/mL、芍药苷190.8 μg/mL、氧化芍药苷42 μg/mL、苯甲酰芍药苷47.2 μg/mL、芍药内酯苷70.2 μg/mL的混合对照品溶液，置于冰箱中，4 ℃保存，备用。

2.2 供试品溶液的制备 按照表1配伍，称取各种配置比例的药材，加10倍量水，先浸泡30 min，再煮沸30 min，过滤分离出煎煮液，最后再加10倍量水煎煮30 min。合并煎煮液，浓缩成浓度为0.1 g/mL的原药材溶液，取该浓缩液1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，静置20 min，分出上清液，即得浓度为0.01 g/mL的原药材溶液，为供试品，进样前用0.45 μm滤膜过滤。

2.3 色谱条件 色谱柱：Agilent Extend-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱，0～5 min，5%～10% A；5～12 min，10%～14% A；12～15 min，14%～16% A；15～20 min，16%～18% A；20～25 min，18%～20% A；25～30 min，20%～22% A；30～40 min，22%～25% A；40～50 min，25%～40% A；50～60 min，40%～55% A；60～65 min，55%～5% A。体积流量：1.0 mL/min，进样量：10 μL，柱温：30 ℃，检测波长：230 nm (氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、甘草酸)、276 nm (甘草苷、甘草素)、360 nm (异甘草苷、异甘草素)。色谱图见图1。

图1 芍药甘草汤的HPLC-DAD色谱图

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液2、5、10、15、20 μL，分别进样。按“2.3”项下色谱条件测定各成分的峰面积，以峰面积积分值为纵坐标(Y)、对照品进样量(μg)为横坐标(X)，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表2。

表2 芍药甘草汤中9个药效组分的标准曲线方程、相关系数和线性范围

2.5 精密度试验 取醋白芍∶炙甘草(12 g∶12 g)配伍药材，制备供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进样，连续6次，测定并计算氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、甘草酸、甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素9个药效组分峰面积的RSD值。RSD值分别为1.65%、1.75%、0.58%、1.91%、1.64%、1.20%、1.02%、1.40%、1.28%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取醋白芍∶炙甘草(12 g∶12 g)配伍药材，制备供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进样，分别于配制后0、4、8、10、12、24 h进样，测定并计算氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、甘草酸、甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素9个药效组分峰面积的RSD值。RSD值分别为1.96%、1.19%、1.32%、1.91%、1.53%、1.17%、1.43%、1.43%、1.29%，表明24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.7 重复性试验 取醋白芍∶炙甘草(12 g∶12 g)配伍药材，平行制备6批次供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进样，测定并计算氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、甘草酸、甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素9个药效组分峰面积的RSD值。RSD值分别为1.00%、1.83%、1.84%、2.00%、1.75%、1.56%、0.92%、1.34%、0.96%，表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率实验 精密吸取已知含量的醋白芍∶炙甘草(12 g∶12 g)水煎液1 mL，平行6份，分别精密加入等量对照品溶液，制备成供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样，氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、甘草酸、甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素9个组分的平均回收率依次为99%、99%、99%、100%、100%、101%、99%、100%、101%，RSD值分别为1.28%、1.32%、2.12%、2.4%、1.18%、2.33%、0.89%、0.53%、2.53%。

2.9 样品测定 分别制备3批次供试品，每批供试品连续进样3次，进样量10 μL，测定峰面积，根据外标法计算各组分含量，结果见表3、表4，图2～图5。

表3 醋白芍剂量变化对炙甘草药效组分及组分总量的影响(mg/mL，n=3)

表4 炙甘草剂量变化对醋白芍药效组分及组分总量的影响(mg/mL，n=3)

图2 醋白芍剂量的变化对炙甘草药效组分含量的影响

图4 醋白芍剂量变化率与炙甘草及芍药甘草汤药效组分总量变化

图3 炙甘草剂量的变化对醋白芍药效组分含量的影响

图5 炙甘草剂量变化率与醋白芍及芍药甘草汤药效组分总量变化

3 讨论与结论

3.1 醋白芍剂量变化对炙甘草药效组分的影响分析 炙甘草剂量不变，醋白芍从1 g增至18 g，炙甘草的药效组分“甘草酸-甘草苷-甘草素-异甘草苷-异甘草素”的含量发生明显变化(图2)，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。药效组分含量大小(醋白芍∶炙甘草)依次为：12∶12>9∶12>15∶12>6∶12>18∶12>3∶12>1∶12。

醋白芍剂量(g)变化率为94.44%，炙甘草药效组分“甘草酸-甘草苷-甘草素-异甘草苷-异甘草素”含量(mg/mL)的变化率(%)为24.90-28.04-24.02-32.71-21.36 (见图4)，在醋白芍剂量具有较大变化的情况下，炙甘草的药效组分变化相对较小。

结果表明，在炙甘草剂量不变的情况下，单独改变醋白芍的剂量，芍药甘草汤中炙甘草的药效组分发生明显的改变，醋白芍与炙甘草的剂量比越接近1∶1，药效组分含量越高。

3.2 炙甘草剂量变化对醋白芍药效组分的影响分析 醋白芍剂量不变，炙甘草从1 g增至18 g，醋白芍的药效组分“氧化芍药苷-芍药内酯苷-芍药苷-苯甲酰芍药苷”的含量也发生明显变化(图3)，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。药效组分含量大小(醋白芍∶炙甘草)依次为：12∶12>9∶12>15∶12>6∶12>18∶12>3∶12>1∶12，变化规律与“3.1”项描述相同。

炙甘草剂量(g)变化率为94.44%，醋白芍的药效组分“氧化芍药苷-芍药内酯苷-芍药苷-苯甲酰芍药苷”的含量(mg/mL)变化率(%)为40.12-38.77-39.86-26.30-73.21(见图5)，在炙甘草剂量具有较大变化的情况下，醋白芍的药效组分变化相对较大。

结果表明，在醋白芍剂量不变的情况下，单独改变炙甘草的剂量，芍药甘草汤中醋白芍的药效组分也发生明显改变，醋白芍与炙甘草剂量比越接近1∶1，药效组分含量越高。 以上变化规律可能由两个原因共同决定：①炙甘草(醋白芍)药效组分对醋白芍(炙甘草)药效组分的化学性质和溶解性有重要影响[6-9]，炙甘草(醋白芍)剂量增减引起汤剂中炙甘草(醋白芍)药效组分的变化，最终导致芍药甘草汤中醋白芍(炙甘草)的药效组分变化；②炙甘草(醋白芍)剂量变化，改变了煎煮时水的用量，醋白芍(炙甘草)与水的比例越大，表明煎煮时加水量越少，药效组分越难溶出，因此药效组分含量越低，与研究数据相吻合。

3.3 醋白芍、炙甘草剂量变化对9种药效组分总量的影响分析 醋白芍剂量变化，9种药效组分的总量分别为：20.76、18.30、17.98、17.22、17.10、13.34、12.93 mg/mL。药效组分总量大小关系(醋白芍∶炙甘草)依次为：12∶12>15∶12>9∶12>18∶12>6∶12>3∶12>1∶12。炙甘草剂量变化，9种药效组分总量分别为：20.72、18.32、17.71、16.55、12.38、7.74、5.55 mg/mL。药效组分总量大小关系(醋白芍∶炙甘草)依次为：12∶12>12∶15>12∶18>12∶9>12∶6>12∶3>12∶1。

以上数据显示，醋白芍和炙甘草的剂量变化对药效组分总量影响趋势基本一致，但炙甘草剂量变化对组分总量的影响>醋白芍剂量变化对组分总量的影响，可能是由于炙甘草药效组分-甘草酸对其他药效组分有增溶的作用，当炙甘草剂量低时，汤剂中甘草酸含量低，增溶作用不显著。

3.4 剂量变化对醋白芍、炙甘草自身药效组分影响分析 醋白芍、炙甘草剂量变化对其自身药效组分也有影响，配伍中醋白芍或炙甘草的剂量为1、3、6、9、12、15、18 g时，溶液中醋白芍药效组分“氧化芍药苷-芍药内酯苷-芍药苷-苯甲酰芍药苷”和炙甘草药效组分“甘草酸-甘草苷-甘草素-异甘草苷-异甘草素”的含量并没有倍数对应关系，因此，复方中单味药的剂量与其药效组分含量没有线性关系。

3.5 芍药甘草汤9种药效组分的筛选 中药药效组分理论认为，药效组分应与临床疗效相对应，中药的配伍可影响药效组分的溶出，对中药的疗效有很大影响。氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、甘草酸、甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素均具有一定的解痉[10-12]、镇痛[10-12]功效。还有研究证实，甘草酸与芍药苷配伍，在镇痛、解痉、解热、抗炎[13]、抑制胃液分泌和松弛平滑肌方面均有协同增效作用。甘草酸可与中药中多种生物碱起化学反应，生成不易溶解的沉淀物，后者在体内缓慢分解而逐渐发挥药效，使药性发作较缓，从而降低不良反应的发生率，同时，这9种药效组分均为水溶性成分，符合经方水煎的特点。因此，本文以经方芍药甘草汤作为研究对象，选取了与临床疗效相对应的9种药效组分作为研究目标，探讨其药效组分的变化规律。

3.6 芍药甘草汤药效组分的分析方法筛选 笔者分别应用乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.02%磷酸水溶液，流速1、0.8 mL/min，柱温30、35、40 ℃，对比研究在上述条件下的分离结果。结果显示，乙腈-0.1%磷酸水溶液、流速1 mL/min、柱温30 ℃条件下，分离效果最好。

[1] 张贵君.中药药效组分理论与中药组分学[J].中药材,2007,30(2):125-126.

[2] 张春晖,张贵君.中药药效组分理论与中药标准物质[J].中药药效提高与中药饮片质量控制交流研讨会论文集[C].2009.

[3] 张贵君.中药研究的误区思考与创新研发的新思路[J].中国中药杂志,2007,32(13):1367-1369.

[4] 崔相微,张贵君.中药药效组分理论与药效组分的研究模式[J].亚太传统医药,2008,4(9):16-17.

[5] 张贵君.中药质量标准制定须以药效组分为基础[J].中国中医药报,2008,2874:4.

[6] 邹华彬,杜爱琴,夏瑛瑛,等.白芍甘草配伍中不同成分群的溶出关系及识别研究[J].中国中药杂志,2006,31(21):1776-1779.

[7] 何丽仙,黄忠京,谭倪,等.HPLC研究芍药甘草汤合煎与分煎的化学成分变化[J].云南师范大学学报,2009,29(6):32-35.

[8] 王静蓉,马琮瑜,严永清,等.芍药甘草配伍化学变化研究[J].时珍国医国药,2000,11(2):102-104.

[9] 严玉平,由会玲,李国川,等.芍药及不同炮制品在芍药甘草汤中芍药苷含量的差异研究[J].中国药房,2009,20(6):463-464.

[10]郑富超,郑秀丽,郭玉成,等.芍药甘草汤不同配伍比例镇痛作用的实验研究[J].承德医学院学报,2008,25(2):213-214.

[11]薛建国,徐立,时乐,等.生白芍和酒炒白芍对芍药甘草汤解痉镇痛作用的影响[J].南京中医药大学学报,2006,2(5):304-305.

[12]风良元.芍药甘草汤镇痛作用及机理研究[J].中国实验方剂学,2002,8(1):23-25.

[13]张明发,沈雅琴.甘草及其活性成分抗炎与抗炎机制的研究进展[J].现代药物与临床,2011,26(4):261-268.

Influence of compatibility dose with single factor on the active components alignment of classical prescription Shaoyao gancao decoction

ZHU Guang-wei,ZHANG Gui-jun*,WANG Jing-juan,MAO Ying,WANG Meng

(School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China)

Objective To study the influence of compatibility dose changes of honey-fired licorice and vinegar fired paeoniae on the active components alignment of Shaoyao gancao decoction by single factor analysis,and provide the scientific basis for establishing the quality standard of traditional Chinese medicine and rational drug use.Methods Taking single compatibility dose of honey-fired licorice and vinegar-fired paeoniae as carrier,and classical prescription Shaoyao gancao decoction as control,the content of oxypaeoniflora-albiflorin-paeoniflorin-benzoylpaeoniflorin-glycyrrhizic acid (λ=230 nm),liquiritin-liquiritigenin (λ=276 nm),isoliquiritin-isoliquiritigenin (λ=360 nm) were determined by HPLC-DAD multi wavelength scanning method.Results The contents (oxypaeoniflorin-albiflorin-paeoniflorin-benzoylpaeoniflorin) of vinegar-fired paeoniae (12 g) respectively (mg/mL,n=3) were 1.90-0.89-3.45-0.53 when the dose of honey-fired licorice was 12 g;and the contents of vinegar-fired paeoniae were lower when the the dose of honey-fired licorice was 1,6,9,15,18 g.The contents (glycyrrhizic acid-liquiritin-glycyrrhizin-isoliquiritin-isoliquidritigenin) of honey-fired licorice (12 g) respectively (mg/mL,n=3) were 9.06-3.19-0.76-0.77-0.15 when the dose of vinegar-fired paeoniae was 12 g;and the contents of honey-fired licorice were lower when the the dose of vinegar-fired paeoniae was 1,6,9,15,18 g.Conclusion ①When the compatibility dose of honey-fired licorice and vinegar-fired paeoniae changed,the dissolution rate of the active components was significantly different from that of classical prescription Shaoyao gancao decoction (P<0.05);② The closer the dose ratio of vinegar-fired paeoniae and honey-fired licorice is to 1:1,the higher the the dissolution rate of the active components is;③The total contents (6.77～4.15 mg/mL) of the 4 active components in vinegar-fired paeoniae as the compatibility dose of honey-fired licorice changes: 12 g>9 g>15 g>6 g>18 g>3 g>1 g (honey-fired licorice);④The total contents (13.93～10.34 mg/mL) of the 5 active components in honey-fired licorice as the compatibility dose of vinegar-fired paeoniae changes: 12 g>9 g>15 g>6 g>18 g>3 g>1 g (vinegar-fired paeoniae);⑤The influence of honey-fired licorice on the total contents of active components in Shaoyao gancao decoction is greater than that of vinegar-fired paeoniae.

Shaoyao gancao decoction;Active components alignment;Compatibility dose;Single factor

2014-06-19

北京中医药大学中药学院，北京 100102

中药新产品开发与产业化及中药资源保护利用研究(桂科攻10124008-14)

10.14053/j.cnki.ppcr.201502013

*通信作者