黑木耳多糖的止咳化痰药理作用研究

刘 军，王 昕

黑木耳多糖的止咳化痰药理作用研究

刘 军，王 昕

目的 探讨黑木耳多糖(AAP)在氨水致咳小鼠中的止咳化痰作用。方法 将60只小鼠(约6周)随机分成6组：AAP低、中、高剂量组(剂量分别为50、100、200 mg/kg)，桂龙咳喘宁组(500 mg/kg)，氯化铵组(或可待因组)，空白对照组。比较6组小鼠的咳嗽潜伏期、咳嗽次数、咳嗽抑制率、止咳活性以及酚红排泌量。结果 与空白对照组比较，AAP中剂量组和高剂量组小鼠的咳嗽次数均减少(P<0.05)，咳嗽潜伏期延长(P<0.05)。AAP低、中、高剂量组小鼠的潜伏期(F=10.89，P<0.01)、咳嗽次数(F=4.192，P=0.026)比较差异有统计学意义。AAP高剂量组小鼠的酚红排泌量明显高于空白对照组(t=2.695，P=0.015)，而AAP低、中剂量组与空白对照组比较差异无统计学意义。结论 黑木耳多糖有止咳化痰的功效。

黑木耳多糖；止咳化痰；药理作用

0 引言

多糖的分子量较大，是自然界中含量最为丰富的一种生物聚合物，在细胞膜结构中均有存在，参与各种细胞的生理活动。目前提取到的多糖主要为真菌多糖和植物多糖[1]。真菌多糖存在一定的抗肿瘤活性，同时还具有抗衰老、降血糖等各种药理活性[2]。黑木耳是一种药食兼用的真菌，具有润肠通便、活血、止血等功效[3]。其活性物质主要为黑木耳多糖(AAP)。本研究旨在通过提取AAP，研究其在止咳祛痰防治方面的药理活性。

1 资料与方法

1.1 动物 由长春生物制品研究所提供的6周大小的雌雄小鼠(昆明种)，体重(20±2) g。

1.2 仪器 旋转蒸发器(型号：RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂)、分析天平(型号：AL104，梅特勒—托利多仪器公司)、电子天平(型号：YB1201，上海海康电子仪器厂)、鼓风干燥器(型号：DHG-92438-2，上海福玛实验设备公司)。

1.3 试剂 桂龙咳喘宁胶囊(桂龙药业公司，国药准字：20053135)、氯化铵片(呼和浩特制药厂，批号：980112)、磷酸可待因(中国医药工业公司青海制药厂，批号：20100829)。

1.4 方法

1.4.1 制备黑木耳多糖 将5 g黑木耳子实体粉碎过筛，参照最佳的工艺对黑木耳粗多糖进行提取，与提取液合并、浓缩后，加入95%的乙醇溶液，放于 4 ℃冰箱中过夜，离心后获得醇沉物，依次用75%、100%的乙醇及丙酮进行滤洗，冷冻干燥，获取黑木耳粗多糖。

1.4.2 纯化黑木耳粗多糖 ①结合Sevag法与酶法脱蛋白：将1.0 g黑木耳粗多糖与80 mL蒸馏水、稀碳酸钠少许混匀至pH值为7.8，然后滴加4 mL甲苯、0.16 g胰蛋白酶，于39 ℃下放置48 h，加入适量Sevag溶液使V氯仿∶V正丁醇为4∶1，混匀后静置，去除下层有机相及中层凝胶，整个操作重复6次；②小分子去杂质：对所得糖溶液进行去离子透析。

1.4.3 测定多糖含量 ①制作标准曲线：精确称取10 mg葡萄糖于蒸馏水中溶解，获取葡萄糖的标准溶液(100 μg/mL)，参照表1在10只试管中分别加入试剂，分别与5%的苯酚溶液混合(现配现用)后迅速注入浓硫酸混匀，10 min沸水浴后冷却，将0号试管中的溶液作为空白对照，采用490 nm的T60分光光度计测定吸光度，以吸光度(C)为纵坐标、糖浓度(A)为横坐标来绘制糖含量相关的标准曲线，获得回归方程：A=0.020 5 C+0.007 3(R2=0.994 8)。②测定多糖含量的方法：精确称取10 mg的多糖样品溶解于蒸馏水中，至100 mL容量瓶中定容。提取样品糖溶液2 mL于试管内，按照①的操作方法，获得所需的吸光度A值，再参照回归方程即可得C值，计算后方可获得多糖含量。多糖含量(%)=C×样品稀释倍数×测定体积/样品干重×100%；多糖提取率(%)=粗多糖干重×粗多糖中多糖含量/黑木耳子实体干重×100%。

1.4.4 AAP对氨水引咳小鼠的止咳作用 60只小鼠随机分成6组：AAP低、中、高剂量组(剂量分别为50、100、200 mg/kg)，桂龙咳喘宁组(500 mg/kg)，氯化铵组(或可待因组，30 mg/kg)和空白对照组。以20 mL/kg体积给小鼠分别进行连续5 d的灌胃给药，1次/d，给予可待因组和空白对照组小鼠相同体积的溶媒(0.5% CMC-Na)，在最后一次给药1 h后进行实验。实验前0.5 h给可待因组注射磷酸可待因(0.03 g/kg)。在棉球中注入0.2 mL的浓氨水，放入1 L倒扣的钟罩内，随后将小鼠快速置于钟罩内。观察小鼠的咳嗽动作(张大嘴，腹肌收缩，有时会有咳嗽声)，记录小鼠的咳嗽潜伏期(小鼠放入至出现咳嗽的时间)及在3 min内咳嗽的次数。咳嗽抑制率(%)=(空白对照组平均咳嗽数-给药组平均咳嗽数)/空白对照组平均咳嗽数×100%；止咳活性(%)=给药组咳嗽抑制率/可待因组咳嗽抑制率×100%。

1.4.5 AAP对小鼠酚红排泌反应的影响 小鼠分组及灌胃方式同“1.4.4”。开始实验前12 h内禁食不禁水，最后一次给药0.5 h后，按照10 mL/kg体积注射5%的酚红溶液于各组小鼠的腹腔内。0.5 h后处死，将气管周围的组织剥去，将甲状软骨下至气管分支处一段气管剪下放入试管中，注入0.1 mL 1 mol/L氢氧化钠以及2 mL生理盐水进行充分振荡，在546 nm处测定上清液的吸光度(A)值。

2 结果

2.1 黑木耳多糖的止咳效果 见表1。咳嗽相关指标包括咳嗽潜伏期、咳嗽次数、咳嗽抑制率及止咳活性。与空白对照组比较，AAP中剂量组和高剂量组小鼠的咳嗽次数均减少(P<0.05)，而咳嗽潜伏期延长(P<0.05)；AAP低、中、高剂量组小鼠的潜伏期(F=10.89，P<0.01)、咳嗽次数(F=4.192，P=0.026)比较差异有统计学意义，低剂量组小鼠的潜伏期最短，咳嗽次数最多；而高剂量组小鼠的潜伏期最长，咳嗽次数最少。

表1 6组小鼠咳嗽相关指标比较(n=10)

注：*与空白对照组比较，P<0.05

2.2 黑木耳多糖的化痰效果 6组小鼠的酚红排泌量比较见表2。结果表明，AAP高剂量组小鼠的酚红排泌量明显高于空白对照组(t=2.695，P=0.015)，而AAP低、中剂量组与空白对照组比较差异无统计学意义。

表2 6组小鼠的酚红排泌量比较

注：*与空白对照组比较

3 讨论

真菌多糖类物质具有降血脂、调节免疫、抗病毒、抗氧化及抗肿瘤等生物活性，被称为“生物反应调节剂”[4]。AAP是黑木耳的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化的生物活性[5]，但其是否具有止咳化痰的药理作用，目前还存在争议。

本研究采用小鼠酚红排泌法和小鼠氨水引咳法对AAP的止咳祛痰作用进行了一定的研究。选择中药和西药两种阳性药分别进行试验，结果发现，中剂量AAP能明显降低氨水导致的小鼠咳嗽次数，止咳活性为31.9%，咳嗽抑制率为17.8%。高剂量的AAP能显著降低氨水导致的小鼠的咳嗽次数、延长引咳潜伏期，止咳活性为35.8%，咳嗽抑制率为20.1%。AAP对咳嗽次数及咳嗽潜伏期这两个镇咳指标的影响基本一致。高剂量AAP能使小鼠气管段的酚红排泌量显著上升，起重要的化痰作用[6]。

慢、急性支气管炎急性发作主要是由于细菌及病毒感染在一定程度上抑制了纤毛细胞活性和肺泡巨噬细胞具有的吞噬功能，从而继发细菌感染所引起的疾病，也可由其他化学和物理刺激引起，从属于中医“痰饮”、“咳嗽”等范畴[7]。中医理论认为，外感咳嗽多因六淫之邪犯肺导致。中医治疗往往采用化痰与镇咳并行的措施[8-9]。本研究也同时观察了AAP的祛痰和止咳作用。

将酚红注入小鼠腹腔，经吸收后，部分酚红被分泌进入气道，如果气管分泌液上升时，经呼吸道粘膜释放的酚红亦上升，因此气管内的酚红排泌量能作为药物祛痰作用测定的一项指标，实验过程中所测的吸光度值越高，酚红的排泌量越多，说明药物祛痰的作用越强。本试验结果提示AAP高剂量存在化痰的作用[10]。

AAP是一种免疫活性多糖，能对机体的免疫功能进行有效的调节，帮助人体祛除“外邪”，进而达到止咳祛痰的目的[11]。当然，AAP是否能作为一种止咳化痰药物，而得到广泛的应用，还需要进一步的大量研究来证实。

[1] Nguyen TL,Chen J,Hu Y,et al.In vitro antiviral activity of sulfated Auricularia auricula polysaccharides[J].Carbohydr Polym,2012,90(3):1254-1258.

[2] Nguyen TL,Wang D,Hu Y,et al.Immuno-enhancing activity of sulfated Auricularia auricula polysaccharides[J].Carbohydr Polym,2012,89(4):1117-1122.

[3] Xu S,Xu X,Zhang L.Branching structure and chain conformation of water-soluble glucan extracted from Auricularia auricula-judae[J].J Agric Food Chem,2012,60(13):3498-3506.

[4] 王献友,陈培云,吴广臣,等.黑木耳多糖提取及其药理活性的研究进展[J].南方农业学报,2012,(5):683-687.

[5] 何彩梅,唐政.黑木耳多糖的提取工艺研究[J].北方园艺,2013,(7):156-158.

[6] Li C,Mao X,Xu B.Pulsed electric field extraction enhanced anti-coagulant effect of fungal polysaccharide from Jew's ear (Auricularia auricula)[J].Phytochem Anal,2013,24(1):36-40.

[7] Ma H,Xu X,Feng L.Responses of antioxidant defenses and membrane damage to drought stress in fruit bodies of Auricularia auricula-judae[J].World J Microbiol Biotechnol,2014,30(1):119-124.

[8] Fan X,Zhou Y,Xiao Y,et al.Cloning and characterization of two allelic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase genes in Auricularia auricula-judae[J].World J Microbiol Biotechnol,2014,30(1):181-189.

[9] Chen G,Luo YC,Ji BP,et al.Hypocholesterolemic effects of Auricularia auricula ethanol extract in ICR mice fed a cholesterol-enriched diet[J].J Food Sci Technol,2011,48(6):692-698.

[10]Reza MA,Jo WS,Park SC.Comparative antitumor activity of jelly ear culinary-medicinal mushroom,Auricularia auricula-judae (Bull.) J.Schrot.(higher basidiomycetes) extracts against tumor cells in vitro[J].Int J Med Mushrooms,2012,14(4):403-409.

[11]Reza A,Choi MJ,Damte D,et al.Comparative Antitumor Activity of Different Solvent Fractions from an Auricularia auricula-judae Ethanol Extract in P388D1 and Sarcoma 180 Cells[J].Toxicol Res,2011,27(2):77-83.

Pharmacological action on the relieving cough and sputum effect of Auricularia auricula polysaccharide

LIU Jun,WANG Xin

(Department of Pharmacy,Xiangyang Hospital,Hubei University of Medicine,Xiangyang 441000,China)

Objective To study the pharmacological action of relieving cough and sputum of auricularia auricula polysaccharide(AAP) in mice with cough induced by ammonia.Methods The 60 mice (about 6 weeks) were divided into 6 groups: low dose (50 mg/kg) AAP group,middle dose (100 mg/kg) AAP group,high dose (200 mg/kg) AAP group,Guilong Kechuanning capsule (500 mg/kg) group (GK group),Ammonium chloride group (codeine group) and the blank control group (control group).The incubation of cough,frequency of cough,inhibition ratio of cough,antitussive activity and the excretion volume of Phenolsulfonphthalein in 6 groups were compared.Results Compared with control group,the frequency of cough of middle dose AAP group and high dose AAP group decreased (P<0.05),and the incubation of cough was longer(P<0.05).There were significant differences in the frequency of cough and the incubation of cough among the three doses of AAP groups(P<0.05).The excretion volume of phenolsulfonphthalein in high dose AAP group was obviously higher than that of control group,there was no significant difference between the low dose/middle dose AAP groups and control group.Conclusion Auricularia auricula polysaccharide has the effect of relieving cough and reducing sputum.

Auricularia auricula polysaccharide;Relieving cough and sputum;Pharmacological action

2014-05-28

湖北医药学院附属襄阳医院药学部，湖北 襄阳 441000

10.14053/j.cnki.ppcr.201502018