维生素D受体对急性肝脏损伤保护作用的研究

赵 晴,娄 岩，李 丹,付 瑜,孙 灿,孔 娟*

维生素D受体对急性肝脏损伤保护作用的研究

赵 晴1,娄 岩2，李 丹3,付 瑜1,孙 灿1,孔 娟1*

目的 探讨维生素D受体在内毒素感染时对肝脏的保护作用。方法 随机抽取C57 BL/6源性的野生小鼠10只和维生素D受体(VDR)敲除小鼠10只，分为对照组和实验组，实验组LPS 15 mg/kg腹腔注射。应用免疫组化及免疫荧光法、实时定量PCR法等方法测定小鼠血浆中的谷草转氨酶含量、细胞因子及进行PAI-1在肝脏组织中的定量分析。结果 注射LPS后，VDR敲除鼠肝脏中的巨噬细胞阳性染色明显多于对照组。VDR敲除组血浆AST水平明显高于对照组。在基因敲除鼠肝脏中伤害性细胞因子IL-2、IL-18、IL-12、IFN-γ明显升高，而保护性细胞因子IL-10明显降低。PAI-1在VDR敲除鼠的肝脏中表达明显增多。结论 VDR在内毒素对肝脏损伤时能够起到保护作用，为进一步研究维生素D及其信号系统的功能提供了理论依据。

维生素D；内毒素；细胞因子；纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)

0 引言

维生素D是核受体家族的一员，通过与维生素D受体(VDR)结合而发挥调节下位基因的作用[1]。VDR广泛存在于各种组织和器官中，与活化的1,25(OH)维生素D结合，调节下游信号系统。研究发现，VitD具有广泛的生理功能，除调节体内钙磷平衡外，近十几年研究发现，维生素D通过其受体不仅调控脂肪细胞的发生[2]、脂代谢[3]、糖代谢[4]、免疫系统[5]，还通过调节肾素-血管紧张素系统对心血管[6]、肾、脑以及动物的行为等功能进行调控，并影响神经、生殖、内分泌、上皮及毛发生长等，故有学者认为维生素D是一种激素而不是维生素，称之为VitD内分泌系统。1,25(OH)维生素D3通过刺激巨噬细胞发挥作用，可以帮助免疫反应的启动[7]。维生素D缺乏已被证实与修复免疫反应有关，能降低白细胞的趋化作用和增加感染机会。

本研究应用VDR敲除鼠和野生鼠的比较，探讨维生素D在内毒素对肝脏损伤时的保护作用，为进一步研究维生素D及其信号系统的功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及处理方法 C57 BL/6源性的野生小鼠10只和VDR敲除小鼠10只，2月龄，体重20～25 g，性别不限，室温饲养，饲料为普通动物饲料，自由饮水进食。随机分为对照组、实验组各10只，对照组用同容积生理盐水，实验组用LPS 15 mg/kg腹腔注射。

1.2 免疫组化及免疫荧光法 肝脏组织用配制的10%福尔马林(pH=7.2)固定、石蜡包埋，切片(4 μm/片);常规复水后，孵育一抗过夜;冲洗后孵育二抗室温1 h,DAB染色，或直接室温孵育荧光二抗1 h;脱水封片;用荧光显微镜进行显微照相。特异性抗巨噬细胞抗体购自Santa Cruz公司，货号：MAC387。

1.3 实时定量PCR法测定小鼠肝脏中细胞因子mRNA的表达 将小鼠组织提取后，用TRizol法按照试剂说明书提取总RNA，用美国Invitrogen公司的反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。细胞因子的引物设计使用Primer 3.0设计合成特异性引物mB2M-2，atttcaatgtgaggcgggtggaac，mB2M-1，accggcctgtatgctatccagaaa，mIL1b-1，ccaaaagatgaaggggtgctgct，mIL1b-2，acagaggatgggctcttctt，mTNFa-1，cagaccctcacactcagatca，mTNFa-2，aacctgggagtagacaaggt，mIL12p35-1，gtgaagacggccagagaaaa，mIL12p35-2，agctccctcttgttgtggaa，mTrpc6-1，cctccctaatgaaaccagca，mTrpc6-2，gattgccagcattccaaagt，IL-18P1，aagcttcagaacacaatacataagcc，IL-18P2，gcaggcagcacaccacagg，IL10-1，ataatgcacccacttccca，IL-2，gggcatcacttctaccaggt，IL6-1，cctctggtcttctggagtacc，IL6-2，actccttctgtgactccagc。

1.4 Northern法检测PAI-1基因的表达 用PCR法克隆一段cDNA片段,克隆进入PSK质粒中,经常规扩增后,双内切酶法产生PAI-1探针,凝胶电泳mRNA后转印到尼龙膜上,用P32标记探针杂交转印到X光片上，表达的数值用Image J.软件分析。

1.5 血浆AST含量测定 经心脏取血，抗凝离心后取上清，检测血浆中AST含量，用Sigma公司试剂盒货号Catalog Number MAK055，按说明操作。

2 结果

2.1 免疫组化法结果 经内毒素15 mg/kg腹腔注射6 h后的野生鼠和VDR敲除鼠带有巨噬细胞特异性抗moma抗体的肝脏切片的免疫染色显示，在VDR敲除鼠肝脏中的巨噬细胞阳性染色明显多于对照组，见图1。由图1可见，内毒素注射6 h后，VDR敲除鼠肝脏中开始出现巨噬细胞增多，肝细胞损伤逐渐显现。

图1 免疫组化法结果

2.2 血浆谷草转氨酶含量测定 两组小鼠接受LPS 15 mg/kg腹腔注射后18 h，野生型对照组和注射组相比，血浆中的谷草转氨酶含量差异无统计学意义，而注射LPS的VDR敲除组血浆谷草转氨酶水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)。表明维生素D受体敲除后，LPS严重损伤肝细胞，见图2。

图2 血浆中的谷草转氨酶含量测定

2.3 细胞因子水平的变化 经内毒素腹腔注射18 h后，野生型鼠和基因敲除鼠肝脏组织中细胞因子的变化可见，在基因敲除鼠肝脏中伤害性细胞因子IL-2、IL-18、IL-12、IFN-γ明显升高，而保护性细胞因子IL-10明显降低，见图3a、图3b。肝脏内炎性细胞因子的增多代表肝细胞受损严重。

2.4 PAI-1检测 应用Northern试验方法检测PAI-1在肝脏经LPS处理后8 h和16 h的表达，并用Image j.软件定量，可见在注射LPS 8 h以后,VDR敲除鼠的表达增加,16 h表达仍然高于野生鼠。PAI-1的升高标志着肝细胞凝血功能受损，进一步证明内毒素处理后的肝脏在VDR敲除鼠中受损严重。见图4a、图4b。

图3a 内毒素腹腔注射18 h后，野生型鼠和基因敲除鼠肝脏组织中细胞因子比较

图3b 内毒素注射6 h和18 h后，野生鼠和维生素D受体(VDR)敲除鼠肝脏内炎性细胞因子比较

3 讨论

研究表明，内毒素可损伤肝细胞膜，干扰肝细胞线粒体能量代谢过程[8-9]，诱导肝细胞凋亡[10]。内毒素可能主要通过免疫细胞-炎性介质介导肝组织损伤。在体内内毒素首先激活Kupffer细胞，最终激活Kupffer细胞内信号转导系统，刺激细胞因子与炎性介质的合成与释放，包括TNF-α、白介素、白三烯B4和补体C5，趋化循环中的中性粒细胞[11]。

图4a PAI-1在肝脏经LPS处理后8 h和16 h的定量

图4b Northern PAI-1表达法的定量数值

这些被激活的中性粒细胞及单核细胞产生氧自由基，引起脂质过氧化作用破坏肝细胞，释放谷丙转氨酶。

本研究结果表明，在内毒素行腹腔注射6 h后，用巨噬细胞特异性抗体染色的巨噬细胞数量在VDR敲除鼠的肝脏中明显增多(图1)，这些增多的巨噬细胞可能由于LPS的趋化作用来自于血液循环中的单核细胞，也可能是局部肝脏中的Kupffer 细胞，因为LPS腹腔注射后，经腹腔中的肠系膜、大小网膜吸收入血进入肠系膜静脉，到达肝脏，首先对肝细胞产生毒性作用(图2)。正如图2中所示，在野生型鼠体内的谷草转氨酶的含量在注射15 mg/kg LPS后没有明显升高，而VDR敲除鼠体内AST的含量有将近10倍的增加，表明此剂量还没有达到使野生型鼠肝脏受损的剂量，而缺乏VDR鼠的肝脏在极低的剂量下，肝细胞受到严重破坏，谷草转氨酶释放入血，血中含量明显升高，说明有保护肝细胞免受损伤的作用。IL-10 为体内重要的抗炎性细胞因子，通过抑制Th1细胞的增殖和IL-2、IFN、白三烯等细胞因子的产生，从而抑制Th1型免疫应答，降低患者的细胞免疫功能，促进Treg的增殖和活化，从而有利于诱导机体对外来病原的耐受。IL-6是一种由巨噬细胞、T 细胞、成纤维细胞及内皮细胞等多种细胞产生的具有广泛生物学活性的多能单链黏蛋白细胞因子，在正常情况下可调节免疫应答，参与炎症反应和在抗感染防御中起重要作用，而在病理状态下，过度的升高可造成机体的病理性损伤。IL-18 是近年来发现的具有多种调节免疫功能的细胞因子，主要由活化的单核-巨噬细胞Th1 细胞、B细胞、NK细胞等分泌，又能促进Th1细胞增殖和Th1型免疫应答，促进TNF-α、NO、GH-CSF等炎症因子及趋化因子的产生。同时该因子为一种最为强烈的TNF-α诱导因子，而TNF-α又通过正反馈通路刺激单核-巨噬细胞大量分泌IL-18，加速炎症细胞的产生，造成细胞免疫介导的组织炎症性损伤[12]。大量LPS入血虽然可产生直接的毒性作用,但大部分有害作用是由于Mφ受LPS刺激后释放的细胞因子介导的炎症反应,本研究结果表明，维生素D敲除鼠肝脏中的伤害性细胞因子明显高于野生型,而保护性细胞因子IL-10明显低于野生型。研究表明，肝脏组织中的细胞因子绝大多数由巨噬细胞产生。如果前几种细胞因子分泌过多，在肝脏局部会产生破坏肝组织细胞的作用。PAI-1是生理上抑制纤溶酶原激活的抑制剂，是体内最重要的纤溶活性调节因子，与多种血栓性和出血性疾病密切相关[13]。本研究中PAI-1在维生素D敲除鼠肝组织中表达增加。从图4的结果看来，在内毒素行腹腔注射8 h后，维生素D敲除鼠肝脏内PAI-1的表达明显高于野生鼠，16 h PAI-1在维生素D敲除鼠肝脏中的表达仍然明显增多。表明PAI-1可能参与了LPS对肝脏的损伤作用。PAI-1在肝脏组织中表达的升高进一步标志着维生素D敲除鼠肝脏细胞受损的数目增多,从另一方面证明维生素D受体及其信号系统有保护肝细胞免受损伤的作用。本研究应用LPS经腹腔注射后,研究肝脏中细胞因子和PAI-1表达在维生素D受体敲除鼠和野生鼠体中的变化，因野生鼠中维生素D受体健全，肝细胞受损轻微，而维生素D受体敲除鼠在实验中表现出肝酶升高，炎症性细胞因子增多，凝血受损，肝细胞损伤严重，表明两者差异在维生素D受体上，证明了维生素D受体在内毒素对肝脏损伤时的重要保护作用，从而进一步证明了维生素D受体及其信号系统在伤害性刺激时具有保护肝功能的作用。

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Protective effect of Vitamin D receptor on acute hepatic injury

ZHAO Qing1,LOU Yan2,LI Dan3,FU Yu1,SUN Can1,KONG Juan1*

(1.Department of Clinical Nutrition,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China;2.Department of Computer,China Medical University,Shenyang 110013,China;3.Physical Examination Center,463 Hospital of Chinese PLA,Shenyang 110042,China)

Objective To explore the protective effect of Vitamin D receptor on hepatic injury induced by LPS.Methods The C57 BL/6 mice were randomly divided into control group and experimental group from 10 wild and 10 Vitamin D receptor(VDR)knockout mice respectively.LPS 15 mg/kg i.p.was injected into experimental group.Plasma AST of mice,the change of cytokines and PAI-1 quantity in liver tissue were determined by immunofluorescence,real-time PCR methods.Results Marked accumulation of macrophages were more in the liver of VDR knockout mice after LPS-treated than those in control group.Plasma AST in VDR knockout mice was significantly higher than that in control group.Nocuous cytokines IL-2,IL-18,IL-12,IFN-γ were significantly higher,and protective cytokine IL-10 was significantly lower in the liver of VDR knockout mice than those in control group.PAI-1 was significantly higher in the liver of VDR knockout mice.Conclusion Vitamin D receptor can play a protective role on hepatic injury induced by LPS,which provides a theoretical evidence for further study of Vitamin D and the function of its signal function.

Vitamin D;LPS;Cytokines;PAI-1

2014-09-12

1.中国医科大学附属盛京医院临床营养科，沈阳 110004；2.中国医科大学计算机教研室，沈阳 110013；3.沈阳市军区463医院体检科，沈阳 110042

国家自然科学基金(30971401、81170065)；辽宁省攀登学者计划；辽宁省十百千计划

10.14053/j.cnki.ppcr.201501006

*通信作者