SAA对鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的影响*

江青山，邓 珊，沈宝茗

(南华大学附属第一医院耳鼻喉科，湖南衡阳 421001)

论著·基础研究

SAA对鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的影响*

江青山，邓 珊，沈宝茗△

(南华大学附属第一医院耳鼻喉科，湖南衡阳 421001)

目的 观察血清淀粉样蛋白A(SAA)的超表达和抑制表达对鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的影响。方法 体外培养SAA高表达的pcDNA3.1(+)-SAA-CNE2细胞系和干扰SAA表达的pGPU6/GFP/Neo-SAA-CNE2细胞系，两种细胞由课题组前期重组的SAA高表达pcDNA3.1(+)-SAA质粒及抑制SAA表达的pGPU6/GFP/Neo-SAA质粒分别转染构建。流式细胞仪分析以上两种细胞的细胞周期。平皿克隆实验检测细胞的增殖状况。结果 流式细胞仪检测细胞周期显示SAA表达的增多可促进CNE2细胞分裂。平皿克隆实验显示SAA可使CEN2细胞的增殖能力增强。结论 SAA具有促进人鼻咽癌CNE2细胞增殖和体外迁移浸润的作用。

血清淀粉样蛋白A；鼻咽肿瘤；CNE2细胞；转染；细胞周期

鼻咽癌是一种发生于鼻咽部的恶性肿瘤，占头颈部肿瘤发病率首位，多发于东南亚各国和我国南方。恶性程度高，约90%属低分化鳞癌，主要的治疗方式是放疗。导致鼻咽癌的原因之一是遗传因素，目前已发现多个鼻咽癌相关易感基因。人血清淀粉样蛋白A(SAA)是一组由多基因编码的蛋白家族，位于11号染色体15.1短臂上，属于急性期蛋白。SAA不仅是炎性标志物，也可作为多种肿瘤的血清生物学标志。虽然SAA主要产生于肝脏，但是目前有研究发现，在人类某些正常或肿瘤组织中也有SAA的表达，并且在不同组织的恶性肿瘤发展过程中，血清中的SAA明显有一个高水平[1]。本实验主要研究SAA对人鼻咽癌CNE2细胞分裂增殖能力的影响，探讨其促进肿瘤细胞生长的基本机制。

1 材料与方法

1.1 材料 课题组前期已成功构建的pcDNA3.1(+)-SAA真核表达载体和pGPU6/GFP/Neo-SAA 表达干扰载体。人鼻咽癌CNE2细胞株购自湖南湘雅细胞库。改良型1640培养基购于Hyclone公司。无支原体胎牛血清购自杭州四季青。二甲基亚砜(DMSO)购自Applichem公司。胰酶、G418及GIMSA染液购自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 鼻咽癌CNE2细胞、SAA高表达的pcDNA3.1(+)-SAA-CNE2细胞系及干扰SAA表达的pGPU6/GFP/Neo-SAA-CNE2细胞系，分别设置为空白组、高表达组和低表达组。培养于含12%胎牛血清的1640培养液中，置于37 ℃ 5% CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 流式细胞检测 消化培养瓶中的细胞，转移至10 mL的离心管中，800 r/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀。用5 mL预冷PBS离心洗涤2次，加入预冷的75%乙醇，于4 ℃固定12 h以上。再次加入5 mL预冷PBS 1 000 r/min离心5 min洗涤，弃上清，加入400 μL溴化乙锭(PI，50 μg/mL)，100 μL RNase A(100 μg/mL)，4 ℃避光孵育30 min。用流式细胞仪进行检测，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

1.2.3 平皿克隆实验 取对数生长期各组细胞，制成细胞悬液。取细胞悬液计数细胞数，加入一定量的培养基将细胞悬液按梯度倍数稀释，准备6个直径6 cm的培养皿，每个加入2 mL预温培养液，再分成3组，每组2个培养皿分别加入100、200个细胞，轻轻转动培养皿使细胞分散均匀。将培养皿置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中，培养2周左右，期间适当换液，直至培养皿中可见较大克隆。弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，再加入适量甲醛固定细胞15 min。去固定液，加适量吉姆萨(GIMSA)染液染色10～30 min,流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将培养皿倒置，其上覆盖一张带网格的透明胶片，肉眼下直接观察计数克隆，计数大于10个细胞的克隆数。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。

2 结果

流式细胞仪检测细胞周期显示SAA表达的增多，促进CNE2细胞分裂。平皿克隆实验显示SAA可使CEN2细胞的增殖能力增强。见图1，表1、2。

A:空白组;B:低表达组;C:高表达组。

图1 各组细胞周期变化情况

表1 SAA对各组细胞的细胞周期的影响(%)

表2 不同组别细胞的克隆形成率(%)

3 讨论

SAA基因位于11号染色体15.1短臂上，人类SAA的完整氨基酸序列已经获得，其基因序列和诱导能力在哺乳动物中的表达均高度保守[2]，表明SAA具有重要的生物学功能。目前，已发现多种与鼻咽癌的发生与转移有关的基因，如HPV-DNA基因[3]、Galectin-3基因[4]等，SAA基因也是其中之一。传统上，SAA被认为是一种急性期蛋白，能够诱导炎症细胞的趋化、聚集[5]。虽然SAA主要由肝细胞合成，但是有研究发现，在人类某些正常或肿瘤组织中也同样能够表达SAA，且在不同器官及组织的恶性肿瘤发展过程中，SAA在血清中具有一个明显的高水平。已有研究表明，SAA与肿瘤具有极大的相关性[6]。通过双向电泳/质谱技术研究鼻咽癌中的血清蛋白，结果发现，SAA蛋白在鼻咽癌患者血清中的表达有所增高，SAA是鼻咽癌潜在肿瘤标志物的可能性相对较大[7]。另有研究发现，有淋巴结转移的鼻咽癌患者与无淋巴结转移的鼻咽癌患者比较，前者血清中SAA的表达量相对更高[8-9]。

目前，已有一些研究提示SAA和某些肿瘤的转移有关。戴嵩玮等[10]从肺癌患者血清中鉴定并证实了血清SAA,其敏感性和特异性分别为84.1%和80.0%,表明血清SAA很可能成为肺癌诊断和病情监测的一个标志分子。Ramankulov等[11]研究了98例肾癌患者和55例健康对照者的血清，其中肾癌患者按TNM进一步细化分组，结果发现,SAA的水平在发生转移的患者中有显著上升，从某种意义上说，SAA与肾癌的转移有明显联系。Le等[12]应用表面增强激光解离/电离飞行时间质谱技术发现，SAA是前列腺癌伴骨转移患者血清中有较高特异性和敏感性的蛋白。

本研究通过培养SAA高表达的pCDNA3.1(+)-SAA-CNE2细胞和抑制SAA表达的pGPU6/GFP/Neo-SAA-CNE2细胞，采用流式细胞术及平皿克隆实验，分析SAA对CNE2细胞生长、增殖及细胞周期的影响。初步了解SAA在鼻咽癌CNE2生长增殖中的作用机制，为揭示其在鼻咽癌发生、发展过程中的分子机制提供实验依据。

综上所述，人SAA具有促进肿瘤细胞的分裂增殖能力，在临床上可通过检测和调节SAA的表达来指导鼻咽癌的治疗。

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Effects of SAA protein on biological behavior of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells*

JiangQingshan，DengShan，ShenBaoming△

(DepartmentofOtolaryngological,theFirstAffiliatedHospitaloftheUniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

Objective To observe the effects of over expression and inhibition expression of SAA protein on biological behavior of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells.Methods pcDNA3.1(+)-SAA-CNE2 cell lines of high expression and pGPU6/GFP/Neo-SAA-CNE2 cell lines of interference expression of SAA protein in vitro.These two cells constructed by transfection of pcDNA3.1(+)-SAA plasmid of SAA high expression and pGPU6/GFP/Neo-SAA plasmids of SAA inhibition expression respectively,plasmids of which were previously successfully reconstructed by the research group.Cell cycle of these two cells was analyzed by flow cytometry with PI staining.The ability of cell proliferation was inspected by plate cloning-forming test.Results Flow cytometry showed that with the increase of expression of SAA protein,it had effect on promoting CNE2 cell division.Plate cloning-forming test showed that SAA protein can improve proliferation of the CNE2 cells.Conclusion SAA protein has the effect on promoting proliferation of human nasopharyngeal carcinoma CEN2 cell and migration in vitro.

serum amyloid A protein;nasopharyngeal neoplasms;CNE2 cell;transfection;cell cycle

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.06.006

湖南省卫生厅科研基金资助项目(B2010-047)。 作者简介：江青山(1971-)，副主任医师，硕士，主要耳鼻喉科疾病的诊治与研究。△

,E-mail：shenbaoming@163.com。

R856

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1671-8348(2015)06-0736-02

2014-11-08

2014-12-15)