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蚂蟥药材的指纹图谱研究*

2015-06-01张丽艳

西部中医药 2015年10期
关键词:蚂蟥迁移率凝胶电泳

刘 君,张丽艳

1辽宁省中医药研究院中药炮制研究室,辽宁 沈阳110034;2辽宁中医药大学基础医学院

蚂蟥药材的指纹图谱研究*

刘 君1,张丽艳2

1辽宁省中医药研究院中药炮制研究室,辽宁 沈阳110034;2辽宁中医药大学基础医学院

目的:研究蚂蟥药材的指纹图谱。方法:采用SD S-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,分离蚂蟥药材提取物中的蛋白质类成分,采用凝胶图像处理系统进行分析。结果:电泳图谱清晰,指纹图谱共有条带10条,非共有峰面积<10%,经方法学考察,RSD%均小于3%。结论:方法稳定,可靠,且重现性良好。

水蛭;蚂蟥;指纹图谱

蚂蟥(Whitmania pigra Whitman),为水蛭科动物蚂蟥的干燥全体,又叫宽体金钱蛭,是一味经典的破血逐瘀药,其药性咸、苦、平,有小毒,归肝经。蚂蟥具有破血通经,逐瘀消癥之效,临床用于治疗血滞经闭,癥瘕积聚,跌打损伤等瘀血阻滞之症[1]。蚂蟥是《中国药典》一部(2010版)收载的中药水蛭的3个品种之一。蚂蟥主产于中国,在临床上应用广泛,为水蛭药用的主流品种[2]。许多研究资料表明,中药水蛭中主要的活血作用为抗凝血,而其抗凝血的主要成分为多肽及蛋白质类[3]。而笔者前期研究结果表明,蚂蟥水溶性成分具有良好的抗凝血作用。本研究采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,对蚂蟥药材提取物中蛋白类成分进行有效的分析分离,并进行指纹图谱研究,对蚂蟥药材的质量标准研究提供研究方法,为其药材的合理使用及开发提供研究思路。

1 材料与方法

1.1 蚂蟥药材 购于江苏沛县,经中国海洋生物研究所鉴定为蚂蟥。本实验采用干品药材,系10月份捕捉后洗净,用沸水烫死,晒干或低温干燥,备用。

1.2 M H-3对照品 为从中药蚂蟥中提取出来的蛋白质单体,为本实验室自制,经采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其相对分子量约为15580Da。

1.3 试剂 所有试剂皆为分析纯。

1.4 试验方法

1.4.1 指纹图谱 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。

1.4.2 供试品制备 取蚂蟥药材,粉碎,取粉末1 g,精密称定,加入蒸馏水50 mL,置匀浆器中匀浆,放置过夜,冷藏(-4℃),离心,取上清液定容于100 mL量瓶中备用。

1.4.3 对照品溶液的制备 精密称取MH-3冻干粉,加重蒸馏水制成每1 mL含100 μg的溶液,备用。

1.4.4 电泳条件及系统适用性试验 仪器:DYYIII-24A型垂直板凝胶电泳槽;ECP-3000型三恒电泳仪,由北京六一仪器厂提供,Kodak 265变焦数码相机为美国伊士曼柯达公司提供GIS-700D凝胶图象处理系统,由上海天能科技有限公司提供。

1.4.5 测定方法 精密吸取供试品溶液20 μL,对照品10 μL分别加入凝胶板加样孔中,分离胶浓度:12.5%;浓缩胶浓度:5%。电流恒定在16 mA,待指示剂距前沿约1 cm时,停止电泳,取出,固定,染色,得电泳胶片。用GIS-700D凝胶图象处理系统测定各条带的迁移率及条带面积,电泳图谱如下:

图1 蚂蟥药材的电泳指纹图谱

图2 蚂蟥药材电泳指纹图谱的条带号

1.4.6 指纹图谱 药材指纹图谱技术参数见表1—2。

表1 蚂蟥药材标准指纹图谱相对迁移率

表2 蚂蟥药材电泳标准指纹图谱相对条带面积

蚂蟥药材指纹图谱共有条带10条,供试品指纹图谱中与参照物MH-3相应的条带为9号,将其作为内标物,非共有峰面积<10%。

1.4.7 方法学考察

1.4.7.1 稳定性试验 取同一供试品溶液,分别在0、2、4、6、8、12小时内按以上方法检测,结果表明,其相对迁移率RSD%在0.22%~2.96%之间,相对条带面积RSD%在0.31%~1.09%之间。说明在12小时内测定,稳定性试验良好。

1.4.7.2 精密度试验 取同一供试品溶液,连续5次进行测定,其相对迁移率RSD%在0.27%~2.02%之间,相对条带面积RSD%在0.35%~1.67%之间。结果表明仪器的精密度试验良好。

1.4.7.3 重现性试验 取同一批号供试品5份,分别按以上方法测定,其相对迁移率RSD%在0.39%~1.89%之间,相对条带面积RSD%在0.62%~1.74%之间。结果表明,本实验方法的重现性良好[4]。

1.4.8 药材测定 取固定产地(江苏沛县),固定捕捉时间(10月份),加工方法固定的10批蚂蟥药材进行指纹图谱测定,其相对迁移率及相对条带面积见表3—4。

3 讨论

本实验采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,以本实验室自行提取的蚂蟥中的蛋白质单体MH-3作为内标物,对蚂蟥药材进行电泳指纹图谱研究,其图谱清晰,指纹图谱共有条带10条,非共有峰面积<10%,经方法学考察,RSD%均小于3%,方法稳定,可靠,而且重现性良好。

表3 10批药材指纹图谱相对迁移率

表4 10批药材指纹图谱相对条带面积

对动物药指纹图谱的研究是一个值得关注的领域,本研究采用蛋白质电泳指纹图谱技术,建立蚂蟥药材中蛋白类成分的指纹图谱,这种方法利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术,可以将微量的蛋白质检测出来,该方法较为简单、快速、可靠,而且费用较低,为蚂蟥药材的指纹图谱研究建立了一种新的方法,也为动物药指纹图谱的研究提供新思路。

[1] 王蒙萌.水蛭的化学成分及药理作用[J].黑龙江中医药,2008(2):47-48.

[2] 瞿新燕.水蛭的抗凝血作用研究[J].现代中西医结合杂志,2010,19(13):1582-1583.

[3] 李艳玲,赵建平.水蛭化学成分的分离及分析概述[J].辽宁中医药大学学报,2009,11(9):43-44.

[4] 袁晓环,杨旭东,崔荣君,等.水蛭注射液的H PLC指纹图谱[J].中国医药工业杂志,2008,39(7):530-532.

Study on Fingerprint of Leech

LIU Jun1,ZHANG Liyan2
1 Chinese Materia Medica Processing Lab of Liaoning Academy of Chinese Medicine,Shenyang 110034,China;
2 Basic Medical College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

Objective:To study the fingerprint of leech(Whitmania pigra Whitman).Methods:Albumin ingredients of leech extracts were abstracted by adopting SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE),and analyzed by gel imaging processing system.Results:Electrophorogram was clear,there were ten bands in the fingerprints,uncommon peak area<10%,RSD%was less than 3%after investigated by the methodology.Conclusion: The method is stable,reliable and reproducible.

leech;MaHuang;fingerprint

R284.1

A

1004-6852(2015)10-0040-03

2014-10-27

辽宁省教育厅科学技术研究项目(编号2006B058)。

刘君(1971—),女,博士学位,副研究员。研究方向:中药药效物质基础的研究。

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