甘肃当归对乙酰苯肼溶血性血虚小鼠模型的干预作用*

邓 毅，张 明，张艳萍

1甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000；2甘肃中医药大学；3甘肃中医药大学附属医院

甘肃当归对乙酰苯肼溶血性血虚小鼠模型的干预作用*

邓 毅1，2，张 明2，张艳萍3

1甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000；2甘肃中医药大学；3甘肃中医药大学附属医院

目的：比较甘肃岷县、礼县、渭源、临夏不同产地当归对乙酰苯肼溶血性血虚小鼠的干预作用。方法：建立乙酰苯肼溶血性血虚模型，给予当归水煎液［1.56 g/(kg·d）］22天后，检测外周血红细胞（RBC）、血红蛋白（H G B）、红细胞压积（H CT）、白细胞（W BC）、血小板（PLT）、红细胞膜钠-钾-A TP酶（N a+-K+-A TP）和钙-镁-A TP酶（Ca2+-M g2+-A TP）活性，并观察肝脏指数（LI）、脾脏指数（SI）、胸腺指数（TI）的变化。结果：与模型组比较，岷县当归能提高RBC、H G B、H CT降低W BC、PLT（P＜0.05），临夏当归能提高H G B、H CT降低W BC、PLT（P＜0.05），渭源当归能提高H G B、H CT降低PLT（P＜0.05），礼县当归能降低PLT（P＜0.05）；岷县当归能提高N a+-K+-A TP酶、Ca2+-M g2+-A TP酶活性（P＜0.05），礼县当归能提高N a+-K+-A TP酶活性（P＜0.05），临夏当归能提高Ca2+-M g2+-A TP酶活性（P＜0.05）；甘肃产各当归均能降低LI（P＜0.05），有降低SI的趋势，岷县、礼县、渭源当归能升高TI（P＜0.05）。结论：甘肃当归［1.56 g/(kg·d）］具有明显改善乙酰苯肼溶血性血虚小鼠外周血象相关指标,提高红细胞膜A TP活性，降低肝脾指数，升高胸腺指数的作用，综合比较岷县当归作用较强。

甘肃当归；溶血性血虚；外周血象；红细胞膜A TP酶；器官指数

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv) Diels.的根，主产于甘肃省东南部的岷县(秦州)，其性甘温质润，长于补血，为“补血之圣药”［1］。甘肃岷县当归历代均被誉为道地药材，《本草求真》云：“当归专入心。辛甘温润，诸书载为入心生血上品。”故用当归补心血，心得血养则诸证自除［2］。本实验考察甘肃不同产区当归对乙酰苯肼溶血性血虚小鼠模型的干预作用，为当归的补血作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物 2013年3月购试验所用当归于甘肃岷县、礼县、渭源、临夏及云南，由甘肃中医药大学中药鉴定学教研室杨扶德教授鉴定为正品。当归水煎液的制备：称取各产地当归10 g，分别加水80 mL，浸泡30分钟，煎煮60分钟，过滤，收集药液，药渣中再加入60 mL水煎煮30分钟，过滤，合并两次滤液，水浴浓缩至100 mL，含生药量0.1 g/mL，3～4℃冰箱保存备用［3］。驴胶补血颗粒(九芝堂股份有限公司生产，批号：2012080220)，水溶液制备：取驴胶补血颗粒30 g，加生理盐水配制成90 mL溶解，含原药量0.33 g/mL。

1.2 动物 SPF级昆明种小鼠128只，体质量18～22 g，雌雄各半，由兰州大学实验动物中心提供，动物实验许可证号：SCXK(甘)2013-0002。

1.3 试剂 肝素钠(中国医药集团上海化学试剂公司生产，批号：F20091231)；乙酰苯肼(天津市光复精细化工研究所生产，批号：20130313)；ATP酶测试盒(批号：20130423)，蛋白质快速染色试剂盒(批号：20130503)，考马斯亮蓝G250法，均购于南京建成科技有限公司。

1.4 仪器 Abacus Junior vet5动物血球仪(美国ABBOTT公司提供)；MODEL680酶标仪(美国伯乐公司提供)；Boifuge stratos高速冷冻离心机(美国科俊仪器公司提供)；BS110S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司提供)；XH-B漩涡混匀器(姜堰市康健医疗器具有限公司提供)。

1.5 方法

1.5.1 溶血性血虚小鼠模型的复制 参照文献方法［4-5］，除空白对照组外，其余7组小鼠分别于灌胃第1、4、7、12、17、22天进行皮下注射2%乙酰苯肼(APH)溶液，第一次剂量为200 mg/kg，其余每次剂量为100 mg/kg。

1.5.2 分组与给药 将128只小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组(驴胶补血颗粒组)、岷县当归组、礼县当归组、渭源当归组、临夏当归组、云南当归组，每组16只。模型建立后，空白对照组和模型对照组按15.6 mL/kg生理盐水灌胃；各当归药物组给药剂量根据成人剂量12 g/70(kg·d)，依体表面积比例换算得小鼠用药剂量1.56 g/(kg·d)（含生药量0.1 g/mL），故各当归组均按15.6 mL/kg剂量(含生药量0.1 g/mL)灌胃；阳性对照组给药剂量根据成人剂量40 g/70 (kg·d)，依体表面积比例换算得小鼠用药剂量5.2 g/(kg·d)(含药量0.33 g/mL)，灌胃剂量为15.6 mL/(kg·d)。以上各组灌胃1次/d，连续22天。

1.6 检测指标

1.6.1 外周血象指标的检测 所有各组于末次给药24小时后，眼眶取血20 μL，加入已添加肝素钠的离心管中，用移液枪轻微混匀，采用动物血球仪测定RBC、HGB、HCT、WBC、PLT。

1.6.2 红细胞膜A TP酶活性的检测 眼眶取血后，各组小鼠股动脉采血(肝素钠抗凝)，加4倍生理盐水，使用冷冻离心机3 000 r/min 4℃离心10分钟，弃去上清液，在沉淀的红细胞中加入0.75mL双蒸水，涡旋30秒，放置15分钟，再涡旋30秒，再放置15分钟，使其充分溶血，直至溶质透亮［6］。严格按ATP酶试剂盒(定磷法)操作说明测定红细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

1.6.3 肝脏、脾脏及胸腺指数测定 小鼠取血后处死，取肝脏、脾脏、胸腺称重，以mg/g单位计算肝脏指数、脾脏指数和胸腺指数。

肝脏指数(LI)=肝脏湿重×1 000/体质量(单位g)

脾脏指数(SI)=脾脏湿重×1 000/体质量；胸腺指数(TI)=胸腺湿重×1000/体质量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计分析软件进行数据处理，计量资料数据以表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周RBC、H G B、H CT、W BC、PLT检测结果 模型组的RBC、HGB、HCT和WBC、PLT与空白组比较有显著下降和上升(P＜0.05)。与模型组比较，岷县当归能提高RBC、HGB、HCT及降低WBC、PLT(P＜0.05)，临夏当归能提高HGB、HCT及降低WBC、PLT(P＜0.05)，渭源当归能提高HGB、HCT及降低PLT(P＜0.05)，礼县当归能降低PLT(P＜0.05)。见表1。

2.2 红细胞膜N a+-K+-A TP酶、Ca2+-M g2+-A TP酶活性检测结果 模型组的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性与空白组比较有显著下降(P＜0.05)。与模型组比较，岷县当归能提高 Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(P＜0.05)，礼县当归能提高Na+-K+-ATP酶活性(P＜0.05)，临夏当归能提高Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(P＜0.05)。见表2。

2.3 肝脏、脾脏及胸腺指数测定 模型组的LI、 SI和TI与空白组比较有显著上升和下降(P＜0.05)。与模型组比较，甘肃各当归均能降低LI(P＜0.05)，有降低SI的趋势，岷县、礼县、渭源当归能升高TI(P＜0.05)。见表3。

表1 对小鼠RBC、H G B、H CT、W BC、PLT的影响

表1 对小鼠RBC、H G B、H CT、W BC、PLT的影响

注：与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与空白组比较，◇◇表示P＜0.01（下同）。

组别 只数 剂量/（g·kg-1）RBC(×1012)/L H G B/(g·L-1) H CT/% W BC(×109)/L PLT×109/L空白对照 16 - 13.48±2.21 377.67±44.02 59.27±9.05 7.08±2.28 838.63±201.07模型对照 16 - 8.29±2.31◇◇276.87±9.05◇◇45.67±12.14◇◇13.57±4.84◇◇1295.43±180.05◇◇阳性对照 16 5.20 9.83±1.14*325.94±15.96**54.38±7.04**7.77±3.78**917.73±280.32**岷县当归 16 1.56 10.69±1.65**326.47±34.18**59.69±8.94**9.14±3.53**868.73±204.75**礼县当归 16 1.56 9.29±0.82 300.47±17.42 51.59±5.08 12.02±4.16 918.80±159.23**渭源当归 16 1.56 9.23±1.52 314.00±20.62**55.02±5.47**11.36±3.08 1054.00±211.82**临夏当归 16 1.56 9.44±1.35 304.13±24.80*52.30±7.29*9.66±3.39**1079.00±213.81**云南当归 16 1.56 9.18±1.67 324.64±28.68 51.08±8.60 9.58±3.08 1107.47±242.95

表2 对小鼠红细胞膜N a+-K+-A TP酶 、Ca2+-M g2+-A TP酶的影响(χ±s) μm ol·m gprot-·1hour-1

表2 对小鼠红细胞膜N a+-K+-A TP酶 、Ca2+-M g2+-A TP酶的影响(χ±s) μm ol·m gprot-·1hour-1

组别 只数 剂量/（g·kg-1） N a+-K+-A TP Ca2+-M g2+-A TP空白对照 16 - 26.86±9.74 43.20±14.53模型对照 16 - 11.64±6.17◇◇14.44±8.69◇◇阳性对照 16 5.20 24.24±10.22**36.84±14.70**岷县当归 16 1.56 23.98±8.55**32.74±7.28*礼县当归 16 1.56 21.75±5.81*27.17±16.63渭源当归 16 1.56 18.04±7.86 21.54±15.31临夏当归 16 1.56 13.07±8.50 31.94±16.84*云南当归 16 1.56 18.76±8.64 26.84±13.81

表3 对小鼠LI、SI、TI的影响(±s)

表3 对小鼠LI、SI、TI的影响(±s)

组别 只数 剂量/（g·kg-1） LI/(m g·g-1) SI/(m g·g-1) TI/(m g·g-1)空白对照 16 - 32.92±3.66 2.09±0.49 2.23±0.82模型对照 16 - 48.48±5.39◇◇11.95±2.26◇◇1.48±0.50◇◇阳性对照 16 5.20 41.55±1.98**10.13±2.34*2.18±0.80*岷县当归 16 1.56 40.92±2.53**10.74±1.76 2.17±1.16*礼县当归 16 1.56 44.76±3.25*11.82±2.32 2.05±0.83*渭源当归 16 1.56 43.16±3.03**11.11±2.18 2.05±0.62*临夏当归 16 1.56 44.21±4.59**11.69±3.45 1.95±0.52云南当归 16 1.56 46.87±6.96 11.26±2.64 2.09±0.64

3 讨论

溶血性贫血(hemolytic anemia)是指红细胞破坏加速，骨髓造血功能代偿不足时发生的贫血，多见于红细胞自身异常和红细胞外部异常两类。有分析认为血虚与情志、不良饮食、体质、疾病、失血、生育、药毒损伤有关［7］。本实验采用乙酰苯肼建立溶血性血虚模型，诱导小鼠外周RBC、HGB、 HCT降低，WBC、PLT升高，红细胞膜Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP活性降低，肝脾肿大，胸腺萎缩。RBC为运送氧气的主要媒介且具免疫功能；HGB含量的高低代表着血虚的程度；HCT反映红细胞的浓度；WBC为免疫细胞，具有吞噬异物产生抗体的作用；PLT在止血过程发挥重要作用［8］。红细胞膜结构和功能的完整是红细胞发挥功能的重要保证，而红细胞的功能主要是通过膜蛋白来实现的。细胞膜上的Na+-K+-ATP保持膜内高钾，膜外高钠的平衡，能将ATP分解为ADP并产生能量，对维持红细胞的形态和功能具有重要作用，在血虚状态下其活力明显降低［9］；Ca2+-Mg2+-ATP维持细胞外高钙，细胞内高镁的水平，亦可分解ADP以获得能量［10］。中医认为肝藏血，脾统血为“气血生化之源”，肝脾的功能失常可以引起血虚。脾脏是人体最大的免疫器官，因此脾脏肿大、胸腺萎缩，将导致机体免疫功能低下，在一定程度会引起机体造血机能的低下，表现为中医血虚的病症［11］。本实验结果表明，甘肃当归能明显改善乙酰苯肼溶血性血虚小鼠外周血象，提高红细胞膜ATP酶活性，降低肝脾指数，升高胸腺指数，对乙酰苯肼溶血性血虚小鼠具有较好的治疗作用，综合比较岷县当归作用较强。

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Intervention of Gansu DangGui on the Mice Models with Acetyl Phenyl Hydrazine-induced Hemolytic Blood-deficiency

DENG Yi1,2,ZHANG Ming2,ZHANG Yanping3
1 Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for Traditional Chinese Medicines of Gansu Province(nurturing station),Lanzhou 730000,China;2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine; 3 University Hospital of Gansu Traditional Chinese Medicine

Objective:To compare the intervention of DangGui(Angelica sinensis)of Minxian,Lixian, Weiyuan,Linxia ofGansu province on mice models with acetyl phenyl hydrazine-induced hemolytic blood-deficiency. Methods:The model with acetyl phenyl hydrazine-induced hemolytic blood-deficiency was established and given DangGui water decoction[1.56 g/(kg·d)]for 22 days,to detect red blood cells(RBC),hemoglobin(HGB),hematocrit(HCT),white blood cells(WBC),platelet(PLT),the activity of Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-Mg2+-ATP enzyme in red cell membrane,and observe the changes of liver index (LI),spleen index (SI)and thymus index(TI). Results:Compared with the model group,Minxian Danggui could raise RBC,HGB and HCT but decrease WBC and PLT(P＜0.05),Linxia Danggui could increase HGB and HCT but lower WBC and PLT(P＜0.05),Weiyuan Danggui could increase HGB and HCT,but decrease PLT (P＜0.05),Lixian Danggui could decrease PLT (P＜0.05); Minxian Danggui could improve the activity of Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-Mg2+-ATP enzyme(P＜0.05),Lixian Danggui could improve the activity of Na+-K+-ATP enzyme(P＜0.05),Linxia Danggui could improve the activity of Ca2+-Mg2+-ATP enzyme(P＜0.05);Gansu Danggui could lower LI(P＜0.05),showing the tendency of decreasing SI, Minxian,Lixian and Weiyuan Danggui could increase TI(P＜0.05).Conclusion:Gansu Danggui[1.56 g/(kg·d)] could improve the related indexes in peripheral blood of mice with acetyl phenyl hydrazine-induced hemolytic blood-deficiency obviously,improve the activity of ATP in red blood cell membrane eividently,decrease liver and spleen indexes and increase TI,and Minxian Danggui shows the strongest function comprehensively.

Gansu DangGui;hemolytic blood-deficiency;peripheral blood;ATP enzyme of red blood cell membrane;organ index

R285.5

A

1004-6852(2015)10-0005-04

2014-12-27

甘肃省高等学校基本科研业务费项目(编号2009-4)。

邓毅(1964—)，男，博士研究生导师，教授。研究方向：中药及复方药效基础的应用研究。