黄芪及其提取物对矽肺模型大鼠支气管肺泡灌洗液MMP-2、MMP-9表达的影响*

颜春鲁，陈 丽，胡继宏，岳 嘉，张书楠，慕婷婷，朱俊燚，雒志义

1甘肃中医药大学敦煌医学与转化教育部重点实验室，甘肃 兰州 730000；2天津中医药大学

黄芪及其提取物对矽肺模型大鼠支气管肺泡灌洗液MMP-2、MMP-9表达的影响*

颜春鲁1，2，陈 丽1△，胡继宏1，岳 嘉1，张书楠1，慕婷婷1，朱俊燚1，雒志义1

1甘肃中医药大学敦煌医学与转化教育部重点实验室，甘肃 兰州 730000；2天津中医药大学

目的：观察黄芪及其提取物对矽肺模型大鼠支气管肺泡灌洗液(bronchi al al veol us fl ui d，BA LF)M M P-2和M M P-9表达的影响，探讨黄芪抑制矽肺纤维化的作用机制。方法:SPF级W i st ar雄性大鼠120只，随机分为正常组、模型组、乙酰半胱氨酸组、黄芪水煎液组、黄芪总苷组、黄芪多糖组，每组20只。大鼠水合氯醛麻醉后，采用经气管染Si O2粉尘法复制矽肺模型。干预组注入Si O2粉尘后1d开始用黄芪提取物及黄芪总苷灌胃，正常组及模型组给予等体积的生理盐水灌胃。观察各组肺组织病理改变，行支气管肺泡灌洗术，用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液M M P-2及M M P-9的表达。结果：各时段模型组M M P-2和M M P-9表达较正常组均降低(P＜0.05)，而乙酰半胱胺酸组、黄芪各干预组各时段表达均低于模型组，在28天M M P-2和M M P-9表达均下降(P＜0.05)。结论：黄芪能降低矽肺模型大鼠支气管肺泡灌洗液M M P-2、M M P-9的表达，这可能是其抑制矽肺纤维化形成的机制之一。

黄芪；矽肺；M M P-2；M M P-9

肺纤维化效应细胞分泌的生物活性分子基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinase，MMP)在细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)的合成和降解中具有重要意义。而在MMP家族中，MMP-2和MMP-9的特异性底物是IV型胶原，同时IV型胶原是肺泡壁基底膜的重要成分。肺间质纤维化过程中很重要的部分即肺泡上皮细胞和基底膜的损伤［1］。笔者用黄芪及其提取物治疗SiO2所致矽肺纤维化，在肺纤维化形成过程中的不同阶段提取支气管肺泡灌洗液，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MMP-2和MMP-9的表达，从而对黄芪治疗矽肺的机理进行探讨。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性Wistar大鼠120只，由甘肃中医学院实验动物中心提供(实验动物合格证号：SCXZ(甘)2011-0001-0001302)，体质量180～220 g。随机分为正常组、模型组、乙酰半胱氨酸组、黄芪水煎液组、黄芪总苷组和黄芪多糖组，每组20只大鼠。

1.2 实验药物 SiO2粉尘(Sigma公司，纯度99%，粒子直径在0.5～1.0 μm，80%粒子在1～5 μm)；黄芪水煎液(甘肃中医学院实验中心制作)；黄芪总苷(AST)(南京光润生物制品有限公司生产，批号GR20120920AS2)；乙酰半胱氨酸泡腾片(富露施，注册证号H20090620)；大鼠基质金属蛋白酶2 (MMP-2)ELISA检测试剂盒(上海源叶生物科技有限公司生产，批号：20130608B)；大鼠基质金属蛋白酶9(MMP-9)ELISA检测试剂盒(上海源叶生物科技有限公司生产，批号：20130608B)。

1.3 仪器 MOD-EL680型全自动酶标分析仪(美国伯乐公司提供)；BL121SS型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司提供)；GL-20A全自动冷冻高速离心机(湖南仪器仪表总厂离心机厂提供)；721分光光度计(上海第一医学院仪器厂提供)；BX41显微镜系统(日本奥林巴斯)等。

1.4 方法

1.4.1 造模 大鼠水合氯醛麻醉后，采用经气管染SiO2粉尘法复制矽肺模型。各干预组注入SiO2粉尘后1天开始用药物灌胃，正常组及模型组给予等体积的生理盐水灌胃。

1.4.2 给药 黄芪水煎液组给药量：20 g/kg，黄芪总苷(AST)给药量：20 mg/kg，黄芪多糖给药量：40mg/kg，乙酰半胱氨酸泡腾片给药量：200mg/kg。

1.4.3 检测指标 第7、14、28天分批处死大鼠，观察肺组织病理改变，采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测支气管肺泡灌洗液 MMP-2和MMP-9活力。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0分析软件对数据进行单因素方差分析。结果采用(±s)表示，用SNK-q检验进行组间两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物活动状态 大鼠造模后饮水和饮食均恢复，但模型组有个别大鼠精神不振。随后观察发现，正常组大鼠饮水、饮食及精神均正常；而模型组与其他各个干预组均发现大鼠饮水及饮食明显减少，精神状态差，对刺激的反应较迟钝，嗜睡，毛发蓬松，色晦暗。

2.2 肺脏外观肉眼观察 正常组大鼠肺脏呈粉红色，表面光滑，弹性良好。模型组第7天可见大鼠双肺呈鲜红色，有散在出血点，体积增大，第14天两肺处显暗红色陈旧出血，第28天可见双肺苍白、体积较小、弹性差、硬度增加、表面凸凹不平。各干预组和模型组病变基本一致，但程度较轻。

2.3 H E染色形态学检测结果 黄芪水煎液组在28天可见炎症改变，巨噬细胞浸润，肺泡腔和肺间质可见含尘巨噬细胞灶，肺泡融合呈不同程度肺气肿改变；矽肺模型组28天有肺间质炎症细胞浸润，主要为巨噬细胞和淋巴细胞，并有明显矽结节出现，见图1。

图1 黄芪水煎液组与模型组第28天肺组织比较(H E染色，×400)

2.4 支气管肺泡灌洗液M M P-2和M M P-9表达的检测 不同时期模型组与正常组MMP-2表达的差异均有统计学意义(P＜0.05)，而乙酰半胱氨酸组MMP-2 (7、14、28天)表达较同期模型组下降(P＜0.05)，黄芪水煎液组、黄芪总苷组和黄芪多糖组在第28天MMP-2表达与模型组比较均下降(P＜0.05)，各干预组比较差异无统计学意义，见表1。不同时期模型组与正常组MMP-9表达的差异均有统计学意义(P＜0.05)。乙酰半胱氨酸组和黄芪水煎液组MMP-9在14天、28天表达较同期模型组下降(P＜0.05)，黄芪总苷组和黄芪多糖组在第28天MMP-9表达与模型组比较均下降(P＜0.05)，黄芪总苷组和黄芪多糖组在第28天MMP-9表达与模型组比较亦下降(P＜0.05)，各干预组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表1 大鼠BA LF M M P-2的动态变化 ng/m L

表2 大鼠BA LF M M P-9的动态变化 ng/m L

3 讨论

目前较公认的矽肺发病机制是肺部持续性的炎症反应与纤维化反应交织进行的不可逆过程，早期以炎症反应为主，晚期以肺纤维化为主［2］。我们通过气管注射二氧化硅粉尘悬液，使大鼠肺组织发生改变，建立矽肺模型，实验结果显示，造模大鼠均有不同程度的活动减少、嗜睡、少吃等症状。通过观察其病理变化，发现模型组大鼠在第28天有明显矽结节形成，而黄芪水煎液组大鼠肺脏同期虽有炎性反应和纤维化的形成，但病变程度较轻，说明黄芪可减轻和缓解矽肺纤维化的进程。

基质金属蛋白酶(MMPs)作为一组细胞外基质降解酶，它可以调节细胞基质的代谢，对肺间质纤维化的病理过程有非常重要的作用。本研究发现在矽肺发生的早期，即肺泡炎阶段MMP-2、MMP-9的表达会明显增加，而在矽肺形成的后期MMP-2、MMP-9虽然较早期有所下降，但仍然表达很高。这说明在肺损伤过程中细胞基质的代谢非常活跃。细胞基质代谢紊乱与矽肺纤维化形成有关。在肺纤维化形成的过程中，总的基质金属蛋白酶在矽肺发生阶段会参与细胞外基质与基底膜的降解，而在修复阶段能够调节肺组织的重塑［3］。

中药黄芪生用有益气固表、利水消肿、托毒生肌功效，蜜炙黄芪有补气、养血、益中功效［4］，临床常用于矽肺的治疗。本实验研究显示，模型组与各干预组MMP-2和MMP-9在第7天时表达最高，然后均逐渐下降，但各干预组下降较快，到第28天时MMP-2和MMP-9水平均基本接近正常，其中乙酰半胱氨酸组下降最为明显。MMP-2能通过分解Ⅳ型胶原蛋白及糖蛋白成分使肺基质成分降解，破坏肺泡壁结构的完整性，从而使成纤维细胞迁移到肺泡腔，造成肺泡腔内纤维化［5］。第28天MMP-2在黄芪各干预组的表达低于模型组，提示黄芪通过抑制MMP-2表达，从而延缓或抑制肺纤维化。肺纤维化大鼠在造模前14天以肺泡炎的病理改变为主，有研究认为MMP-9可能与早期上皮基底膜损伤有关，参与了细胞外基质和基底膜的降解［6］。黄芪水煎液组与乙酰半胱氨酸组的MMP-9明显下降，且在第14天时MMP-9的表达均明显低于模型组，推测黄芪与乙酰半胱氨酸可能是通过抑制MMP-9表达，从而延缓、减轻早期肺泡炎的发生。

综上所述，本实验结果提示，SiO2诱导的矽肺模型在不同时期MMPs的表达不同，以MMP-2和MMP-9增加为主，与有关报道一致，黄芪水煎液及其提取物可能通过抑制MMP-9在肺纤维化大鼠肺内的表达，减轻早期的肺泡炎，抑制MMP-2的表达，延缓和抑制后期肺纤维化的发生。

［1］ Tom ohi t o G，H i rom i chi G，M i t suo T，et al. Rel at i onshi p bet w een abdom i nalfat accum ul at i on and i nsul i n resi st ance i n hem odi al ysi s pat i ent［J］.H ypert en Res，2008，32(1)：83-88.

［2］ 王飞，陈平，曹国平，等.补阳还五汤对肺纤维化大鼠肺泡巨噬细胞肿瘤坏死因子的影响［J］.中药药理与临床，2005，21(3)：5-7.

［3］ 马小兵，曹金玲，朱兰.Si O2对人肺泡巨噬细胞及肺成纤维细胞基质金属蛋白酶及其组织抑制因子表达的影响［J］.现代预防医学，2009，36(18):3526-3528.

［4］ 聂紫雯，魏强华.黄芪免疫调节机制及临床应用进展［J］.中国中医药信息杂志，2009，16(8):103-105.

［5］ O rt i z LA.A nt i fi brot i c t herapy for t he t reat m entof pul m onary fi brosi s［J］. A m J M ed Sci，2001，322(4):213-221.

［6］ W ong S，Bel vi si M G，Bi rrel l M A.M M P/TIM P expressi on profi l es i n di st i nct l ung di sease m odel s；Im pl i cat i ons for possibl e fut ure t herapi es［J］.A MJ Respi r Res，2009，10(1):72-78.

Influence of HuangQi and Its Extractive on the Expressions of MMP-2 and MMP-9 in Bronchial Alveolus Lavage Fluid of Rat Model with Silicosis

YAN Chunlu1,2,CHEN Li1△,HU Jihong1,YUE Jia1,ZHANG Shunan1,MU Tingting1,ZHU Junyi1,LUO Zhiyi1
1 Key Laboratory of Education Ministry Dunhuang Medicine and Translation from Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China;2 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine

Objective:To explore the mechanism of HuangQi(radix astragali)inhibiting silicosis by observing the influence of HuangQi and its extractive on the expressions of MMP-2 and MMP-9 in bronchial alveolus fluid (BALF)of rat model with silicosis.Methods:Altogether 120 SPF rats were randomized into the normal group,the model group,acetylcysteine group,HuangQi decoction group,total glycosides(TG)group of HuangQi and astragalus polysaccharides(APS)group,20 rats each group.Rat model with silicosis were duplicated by SiO2dust dyeing method through air tube after the rats accepted anaesthesia with chloral hydrate.The intervention group accepted intragastric administration of HuangQi extractive and HuangQi TG in one day after injecting SiO2dust,the normal group and the model group accepted intragastric administration of physiological saline in the same volumes.Pathological changes of pulmonary tissue were observed in different groups and bronchoalveolar lavage was performed, the expressions of MMP-2 and MMP-9 in BALF were detected by ELISA method.Results:The expressions of MMP-2 and MMP-9 of the model group were lower compared with the normal group in different times(P＜0.05), while the expressions were lower in acetylcysteine group and HuangQi intervention groups in different times,the expressions of MMP-2 and MMP-9 were decreased at 28 days(P＜0.05).Conclusion:HuangQi could decrease the expressions of MMP-2 and MMP-9 in BALF of rat model with silicosis,and it might be one of the mechanisms of inhibiting silicosis.

HuangQi;silicosis;MMP-2;MMP-9

R285.5

A

1004-6852(2015)10-0022-03

2014-12-27

敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室开放基金(编号D H Y X 1213-002)；甘肃省教育厅第二批科研项目计划(编号1106B-05)；甘肃中医学院中青年基金项目(编号BH 2011-0020)。

颜春鲁(1979—)，男，硕士学位，讲师。研究方向：骨伤疾病的中医药防治。

△通讯作者：陈丽(1981—)，女，硕士学位，讲师。研究方向：心血管与呼吸系统疾病的中医药防治。