一例维吾尔族Gitelman综合征患者的临床与基因突变分析

努荣古丽买买提，张化冰，邢小平

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院内分泌科卫生部内分泌重点实验室，北京1007302新疆维吾尔自治区人民医院内分泌科，乌鲁木齐830001

一例维吾尔族Gitelman综合征患者的临床与基因突变分析

努荣古丽买买提1，2，张化冰1，邢小平1

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院内分泌科卫生部内分泌重点实验室，北京1007302新疆维吾尔自治区人民医院内分泌科，乌鲁木齐830001

目的 探讨1例维吾尔族Gitelman综合征 (Gitelman's syndrome，GS)患者的临床表现及其分子生物学基础。方法 详细收集患者的临床资料、生化检查及影像学检查结果，抽取外周静脉血，提取基因组DNA，聚合酶链反应 (polymerase chain reaction，PCR)扩增SLC12A3基因的26个外显子及其与内含子的交界区，测序确定突变情况。结果 患者临床表现、实验室检查和影像学检查符合GS诊断。基因突变分析显示，患者SLC12A3基因cDNA序列的第1964位鸟嘌呤G纯合突变为腺嘌呤A(c.1964 G＞A)，造成第655位氨基酸由精氨酸改变为组氨酸 (p.Arg655His)，该突变位于SLC12A3的第16外显子。结论 通过SLC12A3基因突变分析，从分子遗传学方面证实1例维吾尔族患者GS的诊断。临床上持续低血钾、肾脏失钾、代谢性碱中毒、血压正常或偏低、低尿钙的患者应考虑该疾病诊断，基因分析有助于确诊。

Gitelman综合征;低钾血症;SLC12A3基因;噻嗪类敏感的钠氯共转运蛋白;基因突变

Med J PUMCH，2015，6(6):427－431

Gitelman综 合 征 (Gitelman's syndrome，GS，OMIM 263800)，是以低血钾、低氯性代谢性碱中毒、低血镁、低尿钙、继发性醛固酮增多和血压正常或偏低为特征的疾病。目前已经明确它主要是由位于16号染色体长臂1区3带 (16q13)的SLC12A3基因突变导致［1］。SLC512A3基因共由26个外显子组成，编码噻嗪类敏感的钠氯共转运蛋白 (Na-Cl cotransporter，NCC)(NM_000339.2;OMIM 600968)。NCC蛋白由1030个氨基酸组成，位于肾脏远曲小管的管腔面，含12个跨膜结构。NCC蛋白的突变可以导致远曲小管对钠和氯吸收障碍，进而导致尿钾、氢、镁丢失增加，而尿钙排泄减少，引起GS特征性的临床表现［2］。GS是一种常染色体隐性遗传疾病，目前在多个种族，包括汉族人中有过报道［3］，但是未见在维吾尔族人群的报道，对于不同民族GS临床表现和分子生物学基础是否存在差异有待进一步研究。本研究将分析1例维吾尔族GS患者的临床、实验室检查和SLC12A3基因突变情况，以对此行进一步探讨。

对象和方法

对象

北京协和医院收治的1例维吾尔族低钾血症患者，经体格检查和实验室检查后，确诊为GS。经患者知情同意，北京协和医院伦理委员会同意，抽取外周血，提取基因组DNA进行SLC12A3基因分析。

实验室和影像学检查方法

激素测定和影像学检查:甲状腺功能、促肾上腺皮质激素、皮质醇、24h尿游离皮质醇、胰岛素样生长因子-1均采用化学发光免疫法测定;完成腹部及肾动脉B超、肾上腺CT扫描等检查。

功能试验:(1)卧立位醛固酮试验:试验日患者空腹过夜，清晨4点排尿后平卧，上午8点卧位取血测肾素活性和醛固酮，然后肌注速尿40 mg，站立2 h，上午10点立位取血测肾素活性和醛固酮水平。(2)卡托普利试验:试验日患者空腹过夜，清晨4点排尿后平卧，上午8点卧位取血测肾素活性和醛固酮水平，然后口服卡托普利25 mg，静卧2 h，上午10点卧位取血测肾素活性和醛固酮水平。

基因分析方法

基因组DNA提取:采用QIAampDNA Blood Mini Kit试剂盒 (Qiagen，德国)提取，参照试剂盒说明提取外周血白细胞基因组DNA。

聚合酶链反应 (polymerase chain reaction，PCR)扩增SLC12A3基因片段:根据GenBank数据库中的SLC12A3基因序列 (NC_000016)设计引物，扩增SLC12A3基因的26个外显子及其与内含子交界区，引物由天一辉远生物技术公司合成，PCR反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性40 s，52～60℃退火40 s，72℃延伸60 s(表1)，循环35次;循环反应结束后，72℃延伸10 min。反应结束后，取5 μl PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物片段大小。

PCR产物直接测序:采用DNA纯化回收试剂盒［天根生化科技 (北京)有限公司］纯化回收PCR产物，送诺赛基因公司用 ABI 3700荧光自动测序仪(ABI，美国)测序。

测序结果分析:测序结果与美国国立生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站数据库进行比对分析 (SLC12A3 cDNA: NM_000339，NCC蛋白:NP_000330)，以确定变异的位点和类型。并进一步与NCBI SNP和Ensemble数据库及人类基因突变数据库 (Human Gene Mutation Database，HGMD)进行比对，排除变异位点为基因多态性位点并确定其是否为未报道过的新突变位点。

结果

临床资料

患者35岁，男性，维吾尔族，以“肢体无力麻木4年”于2012年6月入院。患者于2008年以发热为诱因渐渐出现双手、双下肢麻木伴无力，四肢屈曲不能伸直，伴有心慌、胸闷、气憋不适，急查血钾2.0 mmol/L，予口服补钾后症状逐渐缓解。第2日复查血钾3.02 mmol/L、血钙2.27 mmol/L、血镁0.76 mmol/L，动脉血气pH 7.472，诊断为低钾血症，予口服补钾治疗，出院后自觉症状改善，自行停服。2012年2月因皮肤过敏就医，当时无四肢麻木、肌无力表现，在住院期间查血钾2.8 mmol/L，动脉血气pH 7.472，再次予补钾治疗，每日氯化钾3 g，为进一步确诊收住北京协和医院内分泌科。患者病程中血压正常偏低，100/60 mmHg(1 mm Hg=0.133 kPa)左右，平素口干不明显，夜尿0～2次，无肾结石，大便不干，胃纳可，无呕吐、腹泻，体重无明显变化。既往无利尿剂、肾毒性药物服用史，无毒物接触史。家族史:父母近亲结婚，有2姐，育1女，均体健，至今未发现低血钾。体格检查:血压100/60 mmHg，身高176 cm，体重63 kg，一般情况好，甲状腺未触及，双肺呼吸音清，心率72次/min，齐，双下肢不肿。

实验室和影像学检查结果

实验室检查:动脉血气pH 7.466，HCO3－29.1 mmol/L，血钾2.1 mmol/L、血钠139 mmol/L、血氯96 mmol/L、血钙 2.43 mmol/L、血镁 0.87 mmol/L (正常值0.8～1.0 mmol/L)、肌酐95 mmol/L、血糖4.6 mmol/L，尿常规 (－)，24 h尿钾48.6 mmol、尿钠187 mmol、尿镁6.16 mmol，单次尿尿钙/肌酐比值0.028 mmol/mmol，尿白蛋白肌酐比值0.62 mg/mmol;甲状腺功能、促肾上腺皮质激素、皮质醇、24 h尿游离皮质醇、胰岛素样生长因子-1均正常。

功能试验:卧立位试验中，卧位和立位血浆肾素活性分别为0.43和1.47 ng/(ml·h)，血浆醛固酮水平分别为545和557 pmol/L;卡托普利试验中，服药前后血浆肾素活性分别为0.82和1.65 ng/(ml·h)，血浆醛固酮水平分别为601和491 pmol/L。

表1 SLC12A3基因扩增引物

影像学检查:B超示肝胆胰脾未见异常，双肾肾动脉未见异常;肾上腺CT未见异常。

治疗

患者完善检查后予以补钾治疗，每日补充，血钾维持在3.0～3.5 mmol/L以上。患者一般情况可，无明显四肢无力、麻木表现。

SLC12A3基因突变分析结果

PCR扩增产物检测:以患者DNA为模板，分别用引物进行PCR扩增，产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳EB染色后，均见一清晰条带，且与预期片段大小相符。

基因突变分析:测序结果显示，患者的SLC12A3基因第16外显子发生错义突变，为c.1964G＞A纯合突变，造成第655位氨基酸由精氨酸改变为组氨酸，即p.Arg655His(图1)。与NCBI SNP和Ensemble数据库比对结果表明，SLC12A3 c.1964G＞A不是多态性位点，在HMGD数据库 (http://www.hgmd.cf.ac.uk/)检索发现，c.1964G＞A突变为既往报道过的突变［1］。

图1 SLC12A3基因第16外显子正链部分片段的测序结果图箭头所示为突变位点 (c.1964G＞A→p.Arg655His)

讨论

本例患者35岁，男性，维吾尔族，因“肢体无力麻木4年”就诊。患者有症状时血钾低，明确为低钾血症。血钾低于3.5 mmol/L时24 h尿钾大于25 mmol，没有进食减少、肠道排泄增多、细胞外向细胞内转移等情况，考虑为肾脏失钾。患者同时有代谢性碱中毒，血压不高，不考虑由于盐皮质激素增多或作用增强导致的失钾，同时患者又没有呕吐或使用利尿剂的病史，肾素醛固酮系统检查提示为继发性醛固酮增多症，应该考虑GS或Bartter综合征 (Bartter syndrome，BS)的诊断。

GS和BS综合征都是由于肾小管的离子转运蛋白发生突变，导致钠和氯重吸收障碍，进而引起两者都具备的低钾、血压正常或偏低、继发性醛固酮增多等一系列表现，因此最初认为GS只是BS的一个亚型。但是随着对疾病遗传学和分子机制研究的深入，目前已经明确这两种疾病有不同的发病机制和遗传学背景。BS现在已发现有5种亚型，分别由不同的转运蛋白功能异常引起;而GS则已经明确由SLC12A3基因突变导致噻嗪类敏感的NCC蛋白功能异常所致［2］。由于发病机制不同，GS和BS有不同的临床表现，如GS发病年龄较晚，症状较轻，尿钙降低。本例患者30岁后才出现症状，平时临床表现不明显，尿钙明显降低，符合GS的诊断，但是目前发现BS的Ⅲ型亦可有类似表现［2］，因此基因诊断有助于GS的确诊。

GS的遗传方式为常染色体隐性遗传，患者行基因检测明确为SLC12A3基因c.1964G＞A纯合突变，造成NCC蛋白第655位氨基酸由精氨酸改变为组氨酸，该突变位点已有文献报道［1］，因此患者GS诊断明确。但是文献中对该突变位点的临床表现未作详细报道，因此本例报道有助于进一步了解基因型和表现型的关系。

目前文献中已报道SLC12A3基因突变超过200种，其中超过75%为错义突变，没有明显的突变热点，仅在中国人中发现Thr60Met是最常见的突变位点［2］。本例患者为近亲结婚，可能患者父母均携带相同杂合突变，而杂合突变并不会引起患病，因此父母并没有临床表现。目前没有发现SLC12A3基因型与表现型有明确的关系，有文献提示血镁与病情的严重程度相关［4］，患者的血镁水平正常，与患者病情较轻的表现符合。

目前亚洲患者包括中国汉族患者已经发现的GS突变有50种以上［3，5-6］，在中国健康人群中的研究提示SLC12A3基因杂合突变比例达约3%［7］，但之前未见维吾尔族人群的报道，本例可能为首次报道维吾尔族的GS患者，说明维吾尔族人群同样存在SLC12A3基因的突变。

总之，GS是由SLC12A3基因突变导致的一种少见遗传疾病，临床上持续低血钾、肾脏失钾、代谢性碱中毒、血压正常或偏低、低尿钙应考虑该疾病诊断，基因分析有助于确诊。

［1］Simon DB，Nelson-Williams C，Bia MJ，et al．Gitelman's variant of Bartter's syndrome，inherited hypokalaemic alkalosis，is caused by mutations in the thiazide-sensitive Na-Cl cotransporter［J］．Nat Genet，1996，12:24-30．

［2］Al Shibli A，Narchi H．Bartter and Gitelman syndromes: Spectrum of clinical manifestations caused by different mutations［J］．World J Methodol，2015，5:55-61．

［3］Wang L，Dong C，Xi YG，et al．Thiazide-sensitive Na+-Clcotransporter:genetic polymorphisms and human diseases［J］．Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2015，47:325-334．

［4］Jiang L，Chen C，Yuan T，et al．Clinical severity of Gitelman syndrome determined by serum magnesium［J］．Am J Nephrol，2014，39:357-366．

［5］Li C，Zhou X，Han W，et al．Identification of two novel mutations in SLC12A3 gene in two Chinese pedigrees with Gitelman syndrome and review of literature［J］．Clin Endocrinol(Oxf)，2015，doi:10.1111/cen.12820．

［6］Luo J，Yang X，Liang J，et al．A pedigree analysis of two homozygous mutant Gitelman syndrome cases［J］．Endocr J，2015，62:29-36．

［7］Shao L，Ren H，Wang W，et al．Novel SLC12A3 mutations in Chinese patients with Gitelman's syndrome［J］．Nephron Physiol，2008，108:29-36．

Clinical and Genetic Analysis of a Uyghur Patient with Gitelman's Syndrome

MAIMAITI Nu-rong-gu-li1，2，ZHANG Hua-bing1，XING Xiao-ping1

1Department of Endocrinology，Key Laboratory of Endocrinology of Ministry of Health，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100730，China2Department of Endocrinology，Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital，Urumqi 830001，China

ObjectiveTo analyze the clinical manifestations and molecular basis of a Uyghur patient with Gitelman's syndrome(GS)．MethodsClinical features，laboratory data，and imaging results of this patient were collected．Genomic DNA was extracted from leukocytes of peripheral blood of the patient．Twenty-six exons of the GS gene and their boundaries with introns were amplified by polymerase chain reaction(PCR)．The mutations of the SLC12A3 gene were identified by direct sequencing．ResultsGS was diagnosed based on comprehensive consideration of clinical presentations，laboratory test results，and imaging findings．Gene mutation test revealed a nucleotide substitution of adenine for guanine at the position 1964 of cDNA sequence of SLC12A3 gene (c.1964 G＞A)，which caused a missense mutation of arginine to histidine at codon 655(p.Arg655His)．It occurred at the 16th exon of SLC12A3．ConclusionsSLC12A3 gene mutation analysis confirms the diagnosis of GS in this Uyghur patient from the aspect of molecular genetics．GS should be suspected in patients with persisting hypokalemia，renal potassium loss，metabolic alkalosis，normal or low-than-normal blood pressure，andhypocalcuria．Genetic analysis of SLC12A3 may be helpful to confirm the diagnosis．

Gitelman's syndrome;hypokalemia;SLC12A3 gene;thiazide-sensitive Na-Cl cotransporter;gene mutation

ZHANG Hua-bing Tel:010-69155073，E-mail:huabingzhang@yahoo．com

R589.4;R589.5;R692.6

A

1674-9081(2015)06-0427-05

10.3969/j.issn.1674-9081.2015.06.006

2015-07-23)

张化冰 电话:010-69155073，E-mail:huabingzhang@yahoo．com

国家临床重点专科建设项目 (WBYZ2011-873);北京协和医院中青年科研基金 (pumch-2013-060)