一例原发性肾性糖尿患者的临床与基因突变分析

张化冰，许岭翎，聂 敏

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院内分泌科卫生部内分泌重点实验室，北京100730

一例原发性肾性糖尿患者的临床与基因突变分析

张化冰，许岭翎，聂 敏

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院内分泌科卫生部内分泌重点实验室，北京100730

目的 探讨1例原发性肾性糖尿 (primary renal glucosuria，PRG)患者的临床表现及其分子生物学基础。方法详细收集患者的临床资料、生化检查及影像学检查结果，抽取外周静脉血，提取基因组DNA，聚合酶链反应 (polymerase chain reaction，PCR)扩增SLC5A2基因的14个外显子及其与内含子的交界区，测序确定突变情况。结果 患者临床表现、实验室检查和影像学检查符合PRG诊断。基因突变分析显示，患者SLC5A2基因cDNA序列的第877位腺嘌呤A突变为胸腺嘧啶G(c.877 A＞G)，造成第293位氨基酸由丝氨酸改变为半胱氨酸 (p.Ser293Cys)，该突变位于SLC5A2的第7外显子。蛋白序列的保守性分析和突变蛋白的功能分析均表明p.Ser293Cys为致病性突变。结论 通过SLC5A2基因突变分析，从分子遗传学方面证实患者PRG的诊断。临床上血糖正常的患者出现尿糖阳性且无其他近端肾小管功能障碍表现的患者应该考虑到该疾病可能，基因分析有助于确诊。

原发性肾性糖尿;家族性肾性糖尿;SLC5A2基因;钠-葡萄糖共转运蛋白2;基因突变

Med J PUMCH，2015，6(6):406－409

原发性肾性糖尿 (primary renal glucosuria，PRG，OMIM 233100)，也称为家族性肾性糖尿 (familial renal glucosuria，FRG)，是一种在血糖低于正常肾糖阈 (10 mmol/L)时尿中即出现葡萄糖，同时近端肾小管的其他功能正常的疾病。目前已经明确它主要是由位于16号染色体短臂1区1带2亚带 (16p11.2)的SLC5A2基因突变导致［1］。SLC5A2基因共长7.7 kb，由14个外显子组成，编码SGLT2钠-葡萄糖共转运子。SGLT2蛋白由673个氨基酸组成，是一个低亲和力高容量的钠-葡萄糖共转运子，位于近端肾小管的S1段，含14个跨膜结构。SGLT2蛋白的突变可以导致肾脏葡萄糖重吸收障碍，从而导致在血糖正常时尿中出现葡萄糖。PRG现在被认为是一种常染色体共显性遗传同时不完全外显的疾病［2］。本研究分析1例PRG患者的临床、实验室检查和SLC5A2基因突变情况，旨在探讨PRG患者的临床表现及其分子生物学基础，以提高对本病的认识。

对象和方法

对象

北京协和医院收治的1例肾性糖尿患者，经体格检查和实验室检查后，确诊为PRG。经患者知情同意，北京协和医院伦理委员会同意，抽取外周血，提取基因组DNA进行SLC5A2基因分析。

基因分析方法

基因组DNA提取:采用QIAampDNA Blood Mini Kit试剂盒 (Qiagen，德国)提取，参照试剂盒说明提取外周血白细胞基因组DNA。

聚合酶链反应 (polymerase chain reaction，PCR)扩增SLC5A2基因片段:根据 GenBank数据库中的SLC5A2基因序列 (NG_012892)设计引物，扩增SLC5A2基因的14个外显子及其与内含子交界区，引物由天一辉远生物技术公司合成，PCR反应条件为: 94℃预变性5 min;94℃变性60 s，59～63℃退火30 s，72℃延伸20～60 s(表1)，循环35次;循环反应结束后，72℃延伸10 min。反应结束后，取5 μl PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物片段大小。

PCR产物直接测序:采用DNA纯化回收试剂盒［天根生化科技 (北京)有限公司］纯化回收PCR产物，送诺赛基因公司用 ABI 3700荧光自动测序仪(ABI，美国)测序。

测序结果分析:测序结果与美国国立生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站数据库进行比对分析 (SLC5A2 cDNA: NM003041.3，SGLT2蛋白:NP_003032)，以确定变异的位点和类型。并进一步与NCBI SNP和Ensemble数据库及人类基因突变数据库 (Human Gene Mutation Database，HGMD)进行比对，排除变异位点为基因多态性位点并确定其是否为未报道过的新突变位点。

对突变蛋白的功能预测:首先分析突变位点在不同物种中的保守性，其次使用非同义突变功能预测软件 SIFT(http://sift.jcvi.org/)［3］、Polyphen-2(http:// genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)［4］和 Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org/)［5］对含错义突变的SGLT2蛋白进行致病性预测。

表1 SLC5A2基因扩增引物

结果

临床资料

患者男性，22岁。因“发现尿糖阳性2年”于2011年2月18日来北京协和医院就诊。患者2008年体检时发现尿糖“阳性”，同时查空腹及餐后2 h血糖均正常 (具体不详，化验单已丢失)。2011年2月10日患者在外院查空腹血糖4.8 mmol/L，尿糖 (+++)，尿蛋白 (－)，尿红细胞及白细胞均 (－)。平素患者无明显多饮多尿，夜尿0次，尿中泡沫不多，食欲好，体力好，无体位性低血压，体重无明显变化，大便正常。为进一步明确原因就诊。无泌尿生殖系统感染病史，无毒物接触史，无肾毒性药物使用史。家族史:父母非近亲结婚，父母均无尿糖资料，父亲有糖尿病。体格检查:血压120/70 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，身高168 cm，体重55 kg，一般情况好，双肺呼吸音清，心率80次/min，齐，双下肢不肿。

实验室和影像学检查结果

血液检测:肌酐84 μmol/L，钠142 mmol/L，钾4.1 mmol/L，钙2.28 mmol/L，磷0.95 mmol/L，空腹血糖4.8 mmol/L，餐后2 h血糖6.5 mmol/L，尿酸224 μmol/L，总胆固醇 4.3 mmol/L，甘油三酯0.74 mmol/L，低密度脂蛋白胆固醇2.76 mmol/L，高密度脂蛋白胆固醇1.34 mmol/L;肝功正常;HbA1c 4.9%;血β2微球蛋白1.7 mg/L，血免疫电泳 (－);动脉血气pH 7.41，HCO3－25.6 mmol/L。

尿液检测:尿常规 (空腹及餐后2 h)均为葡萄糖≥55 mmol/L，余 (－)，尿沉渣 (－);24 h尿糖9.6 g。尿氨基酸 (－)，尿白蛋白肌酐比0.92 mg/mmol，尿β2微球蛋白0.581 mg/L，尿免疫电泳 (－)。

影像学检查:肾脏B超示双肾未见明显异常。

SLC5A2基因突变分析结果

PCR扩增产物检测:以患者DNA为模板，分别用引物进行PCR扩增，产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳EB染色后，均见一清晰条带，且与预期片段大小相符。

基因突变分析:测序结果显示，患者的SLC5A2基因第7外显子发生错义突变，为c.877 A＞G杂合突变，造成第293位氨基酸由丝氨酸改变为半胱氨酸，即p.Ser293Cys(图1)。与NCBI SNP和Ensemble数据库比对结果表明，SLC5A2 c.877 A＞G不是多态性位点，在HMGD数据库 (http://www.hgmd.cf.ac.uk/)检索发现，c.877 A＞G突变为未报道过的新突变。

突变蛋白的功能预测:SGLT2蛋白第293位的丝氨酸在人、大鼠、小鼠、兔、牛、大猩猩、马、荷兰猪、恒河猴、狗中高度保守 (图2)。同时，SIFT、Polyphen-2和Mutation Taster软件对错义突变的功能影响预测结果显示:该突变很可能影响SGLT2蛋白的功能，是致病性突变。SIFT和Polyphen-2的评分分别为0.02和0.999(敏感性:0.14;特异性:0.99)。

讨论

本例患者22岁，男性，因“发现尿糖阳性2年”就诊。患者在血糖完全正常时反复检测尿糖阳性，同时肾功能正常，没有其他近端肾小管功能异常的证据，包括没有氨基酸、小分子量蛋白质、碳酸氢根、磷从尿中丢失，可以诊断PRG。

图1 SLC5A2基因第7外显子正链部分片段的测序结果图

图2 不同种属的SGLT2蛋白多序列比对图

正常成人每日从肾小球滤出约180 g葡萄糖，但是终尿中尿糖多小于0.5 g/d，主要是由于近端肾小管的重吸收作用，其占肾脏葡萄糖重吸收的90%以上，因此在血糖正常的情况下尿糖应为阴性。当血糖正常时尿糖阳性，主要是由于近端肾小管重吸收葡萄糖功能异常所致，有两种原因，一种是继发性肾性糖尿，是作为范可尼综合征的一部分，为近端肾小管功能普遍异常，除尿糖阳性外可合并氨基酸、蛋白质、磷、HCO3－重吸收的障碍;除外继发性肾性糖尿后可以诊断为原发性肾性糖尿。

目前研究发现绝大多数PRG是由于SLC5A2基因突变导致的SGLT2蛋白突变造成［6］。其他目前发现的可以影响肾脏葡萄糖重吸收的蛋白还包括SGLT1蛋白，但SGLT1蛋白在肠道和肾脏均有表达，主要表现为肠道对葡萄糖和乳糖的吸收下降，而SGLT1对肾脏葡萄糖重吸收的作用较弱，患者没有肠道表现，不支持SGLT1蛋白突变［7］。目前还发现有一些可能的基因如GLYS1基因可引起肾性糖尿［8］，所以基因诊断有助于PRG病因的确诊。

本例患者行基因检测明确为SLC5A2基因c.877 A＞G杂合突变，造成SGLT2蛋白第293位氨基酸由丝氨酸改变为半胱氨酸，通过对不同种属该位点的蛋白序列的保守性分析及多种点突变功能预测软件分析，均支持该突变为致病突变。

目前文献中已报道SLC5A2基因突变超过70种，没有明显的突变热点［2，8-10］。本例患者的突变亦为新突变，与之前经验符合。目前认为本病的遗传方式为共显性遗传，并且外显不完全，杂合突变即可发病，但是亦有可能不发病，可能取决于功能正常的基因对葡萄糖重吸收的代偿能力［11］。基因型与表现型的关系主要表现为纯合突变和复合杂合突变比单纯杂合突变病情更重，尿糖丢失更多，纯合突变和复合杂合突变尿糖丢失多＞10 g/d，而单纯杂合突变多＜10 g/d［1］，本患者为单纯杂合突变，每日尿糖丢失为9.6 g，与这一规律符合。

PRG患者的临床表现多为良性过程，多数为体检发现，临床症状轻微，与本例患者临床特点相符。尿糖丢失较多的患者可以出现多饮多尿，严重时可出现脱水、低血压的临床表现，但总体来说患者长期随访基本没有严重并发症出现［7］。现在已经有SGLT2抑制剂用于临床治疗糖尿病［7］，对PRG患者的长期随访有助于了解SGLT2抑制剂的长期不良反应。

总之，PRG是由SLC5A2基因突变导致的一种少见遗传性疾病，临床上血糖正常的患者出现尿糖阳性且没有其他近端肾小管功能障碍的表现应考虑该疾病诊断，基因分析有助于确诊。

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Clinical and Genetic Analysis of a Patient with Primary Renal Glucosuria

ZHANG Hua-bing，XU Ling-ling，NIE Min

Department of Endocrinology，Key Laboratory of Endocrinology of Ministry of Health，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100730，China

ObjectiveTo analyze the clinical manifestations and molecular basis of a patient with primary renal glucosuria(PRG)．MethodsClinical features，laboratory data，and imaging results were collected．Genomic DNA was extracted from leukocytes of peripheral blood of the patient．Fourteen exons of the PRG gene and their boundaries with introns were amplified by polymerase chain reaction(PCR)．The mutations of the SLC5A2 gene were identified by direct sequencing．ResultsPRG was diagnosed on the basis of comprehensive consideration of clinical presentations，laboratory test results，and imaging findings．Gene mutation test revealed a nucleotide substitution of guanine for adenine at the position 877 of cDNA sequence of SLC5A2 gene (c.877 A＞G)，which caused a missense mutation of serine to cysteine at codon 293(p.Ser293Cys)．It occurred at the 7th exon of SLC5A2．Loci conservation analysis and functional prediction of missense mutation of SLC5A2 protein revealed that p.Ser293Cys was a pathogenic mutation．ConclusionsSLC5A2 gene mutation analysis confirms the diagnosis of PRG in this patient from the aspect of molecular genetics．It is important to suspect PRG in patients with renal glucosuria and normal blood glucose in the absence of other manifestations ofproximal renal tubular dysfunction．Genetic analysis of SLC5A2 may be helpful to confirm the diagnosis．

primary renal glucosuria;familial renal glucosuria;SLC5A2 gene;SGLT2 protein;gene mutation

NIE Min Tel:010-69155100，E-mail:nm_pumch@aliyun．com

R589.1;R596.2;R692.6

A

1674-9081(2015)06-0406-04

10.3969/j.issn.1674-9081.2015.06.002

2015-07-23)

聂 敏 电话:010-69155100，E-mail:nm_pumch@aliyun．com

国家自然科学基金(81270879);国家临床重点专科建设项目 (WBYZ2011-873);北京协和医院中青年科研基金 (pumch-2013-060)