基于随机引物PCR的几种分子标记技术的概述

李松涛 高立霞 张丽君 曹宏伟 孔青

(山东医药技师学院,山东泰安 271016)

基于随机引物PCR的几种分子标记技术的概述

李松涛 高立霞 张丽君 曹宏伟 孔青

(山东医药技师学院,山东泰安 271016)

本文综述了各种基于随机引物PCR(Polymerase Chain Reaction)的分子标记技术,包括随机扩增多态性DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNA,RAPD)、任意引物PCR(Abitrary Primer PCR,AP-PCR)、DNA?扩增指纹分析(DNA Amplification Fingerprinting,DAF)以及此后在此基础上改进的其他技术,如序列特异性扩增(sequence characterized amplified region,SCAR)、相关序列扩增多态性(sequence-based amplified polymorphism, SRAP)等,就以上分子标记技术的原理、操作步骤、优缺点进行简要概述。

分子标记 RAPD AP-PCR SCAR

随着分子生物学研究的逐渐深入，越来越多的分子标记技术被人们发现并运用，这些技术反过来又促进了分子生物学的发展。目前，分子标记技术按实验方法不同可分为：基于分子杂交的分子标记技术，基于随机引物PCR的分子标记技术，和基于特异引物PCR的分子标记技术。基于随机引物PCR的分子标记技术是在PCR的基础上发展而来，现在已广泛应用于物种鉴别、遗传多样性分析、亲缘关系分析等研究领域。

基于随机引物PCR的分子标记技术最早发现于20世纪90年代初。1990年美国杜邦公司williams等用10碱基的寡核苷酸作为引物扩增多态性DNA成功，并将此技术命名为随机扩增多态性DNA (Randomly Amplifi ed Polymorphic DNA，RAPD)[1]。同时期，Welsh和McClelland发明了AP-PCR[2]，Caetano-Anolles发明了DAF[3]。

RAPD、AP-PCR、DAF三种技术极为相似，都是利用PCR，以随机序列寡核苷酸为引物，对目标基因组DNA进行多态性扩增。当然它们之间也存在一些差别，比如三种技术的随机引物长度有所不同。三种技术中，RAPD更为常用。Franck A.Atienzar等人曾统计，自1990年至2005年，OVID数据库收载的有关RAPD的论文高达8493篇，而AP-PCR、DAF分别约为500篇和150篇[4]。

1 RAPD技术

1.1 技术原理

基因组中存在着丰富的反向重复序列，根据这一特点，RAPD利用随机的寡核苷酸片段作为单一引物对基因组进行PCR扩增。单一引物与上下游的反向重复序列结合，两位点之间的DNA序列就被扩增出来，形成此基因组特异的DNA片段。很多从同一基因组DNA上扩增出来的不同分子量的条带构成了这个基因组的DNA指纹。不同来源的基因组，DNA指纹不同，此即DNA多态性。RAPD结果的多态性源自被扩增区域的染色体不同或引物结合位点的碱基改变。

虽然一条引物检测的多态性有限，但是RAPD实验通常利用多条引物分别对DNA扩增，因而检测区域可能覆盖整个基因组。

1.2 操作步骤

RAPD实际上是一种特殊的PCR，与普通PCR不同之处在于其选用单一随机引物，且退火温度较低。基本步骤可概括为：(1)提取基因组DNA；(2)用10碱基的随机引物，对基因组DNA进行PCR。PCR条件各实验室有所不同，退火温度一般在36℃左右，循环数一般为40-45个循环。(3)PCR产物进行琼脂糖电泳并在紫外灯下观察。(4)分析结果。记录各物种多态性条带的1/0数据，用spss软件计算任意两物种间的相似性系数，或PAUP软件进行聚类分析，建树状聚类图。

1.3 优缺点

与其他分子标记技术相比，RAPD具有以下优点：(1)RAPD不需高端实验设备，只要PCR仪和电泳装置即可满足实验要求。RFLP等分子标记技术需要进行southern blotting、同位素标记等复杂或放射性实验[5，6]。相比之下，RAPD实验操作更简便安全。(2)RAPD的分析对象DNA，在生命体中广泛存在易获取。提取植物DNA，一般不需考虑叶片采集时间，但幼叶中酚的含量较少易于纯化。此外，RAPD所需DNA量相对较少，且蛋白质、RNA污染对实验结果影响不大[7]。(3)引物设计简易，无需知道基因组DNA信息，随机设计10碱基的寡核苷酸序列即可作为引物。(4)由于RAPD所用的随机引物，有些可以扩增DNA的高度保守序列，因此可以将多样性定在较高分类水平。同样，有些引物扩增的是DNA的高度可变区，因而可以用于低水平的种间或种内多样性分析。

尽管RAPD有着诸多优点，但也存在着一些缺陷：首先，RAPD是显性标记，无法有效区分基因组DNA为纯合子还是杂合子；其次，通过RAPD可鉴别出基因多态性，却无从知道多态性位点，也不能确定此位点基因是否影响生物体表型；最重要的是，相对于其他分子标记实验，RAPD技术的可重复性较低[8]。因此，实验中还需摸索DNA含量、模板含量退火温度等信息，以提高可重复性[8，9]。

2 AP-PCR技术

AP-PCR是同时期发现的与RAPD相似的技术。与RAPD相比，AP-PCR引物稍长，一般为20个碱基，且浓度是RAPD的10倍。此外，AP-PCR的PCR操作略显复杂，其过程可分为两个阶段。第一个阶段，低严谨条件下的扩增。此阶段的退火温度较低，因而引物与模板结合时错配较多，这一阶段进行两个循环。第二阶段，高严谨条件下的扩增。此阶段退火温度高，约为60℃，在低严谨退火条件下发生的延伸引物可以继续在高严谨条件下进行扩增。为了得到更清晰的结果，在反应最后的20到30个循环还可加入放射性的32-PdCTP。

AP-PCR最显著的特点是两个低严格性的退火循环，它使PCR的错配处在一个较高的水平，这样检测的多态性更丰富。另外，在有些实验中采用放射性的dCTP作原料，合成DNA条带具有放射性。

3 DAF技术

DAF，也是与AP-PCR、RAPD同时期发现的原理相似的分子标记技术。DAF的单一引物长度更短，一般在5-8个碱基之间，因此多态性更大。条带比RAPD和AP-PCR都多，因而检测出样本之间多态性的可能性会增加。

4 SCAR技术

SCAR(sequence characterized amplified region，序列特异性扩增)是以RAPD为基础发展起来的。与RAPD相比其优势在于，可以确定多态性DNA条带的碱基序列，并将显性标记转化为共显性标记，因此在遗传学上具有重要意义。

在SCAR中，首先要进行RAPD-PCR，扩增出产物后，切割感兴趣的条带并进行测序，然后根据测定序列在原引物3’端添加14个碱基，构成24碱基的引物再进行扩增。SCAR因引物更长，退火温度高，引物与模板结合更具特异性，结果也更准确。SCAR是共显性标记，如果要做显性标记则第二次PCR之后只需染色、不用电泳。

SCAR主要用于将RAPD显性标记转化为共显性标记，以确定基因组是否为纯合子。谢传晓等人把与玉米对生叶突变体对生性状两个显性位点紧密连锁的RAPD标记成功转化成SCAR标记，为对生玉米的分子标记辅助选择奠定了基础[10]。在某些情况下，为了增加实验的稳定性和可靠性，也可将RAPD转化为SCAR，如吴学谦等将SCAR标记用于香菇菌株鉴定上，构建了稳定、准确鉴定香菇菌株的新方法[11]。

5 SRAP技术

SRAP(sequence-based amplified polymorphism，相关序列扩增多态性)，又称为SBAP(sequence-based amplified polymorphism，基于序列扩增多态性)，是于2001年由美国加州大学蔬菜系Li与Quiros博士建立起来的对外显子进行分析的技术[12]。

SRAP与RAPD的最大不同在于其独特的引物设计。SRAP基于外显子富含GC而启动子和内含子富含AT的特点来设计引物，以实现对开放阅读框架(ORF)进行扩增。SRAP所用为一对引物而不是单一引物：上游引物5’端前10个为填充序列，接着是CCGG，3’端是三个选择碱基；下游引物5’端前11个是填充序列，接着是AATT，3’端是三个选择碱基。引物的设计是SRAP实验成功的关键：上游引物、下游引物的长度必须不同，且应注意引物内、引物间不能形成“发夹”等二级结构。

SRAP多态性主要来自于两方面：一方面，插入和缺失导致的片段长度的改变由此产生的多态性，此时SRAP可用做共显性标记；另一方面，核苷酸改变而产生的多态性，此时SRAP只能用作显性标记。

6 RAMPO

RAMPO(random amplified microsatellite polymorphism，随机扩增微卫星多态性)，又称为RAHM(random amplifi ed hybridization microsatellites，随机扩增杂交微卫星)。为了从RAPD中获得更多的多态性信息，在PCR扩增之后，用SSR探针对扩增产物进行southern印迹，这一方法被称为RAMPO或RAHM[13]。SSR探针主要结合在扩增产物的微卫星序列上，因此RAMPO可以从RAPD凝胶上获得更多有关微卫星基因克隆的信息。

7 MS-RAPD(Methylation-Sensitive Random Amplified Polymorphic DNA,甲基敏感随机扩增多态性DNA)

通常DNA多态性是指碱基序列的多态性，但是DNA的甲基化在基因表达调节中起着至关重要的作用。目前，有很多检测DNA甲基化的技术，如，亚硫酸氢盐测序(bisulfi te sequencing)，甲基化CPG岛复原分析(MIRA)，甲基敏感多态性扩增等。其中甲基敏感多态性扩增就是一种基于随机引物PCR的分子标记技术，它包括MSAP-PCR[14]和MS-RAPD[15，16]。

在进行MS-RAPD时，首先利用甲基化敏感的限制性内切酶MSPⅠ、HapⅡ对DNA进行切割，然后将获得的DNA片段进行随机扩增得到多态性DNA。MS-AP-PCR与MS-RAPD技术极为相似，不同在于MS-RAPD最后检测时采用琼脂糖胶，而MS-AP-PCR采用测序凝胶。

8 结语

分子标记作为新的遗传标记，具有简单、高效、重复性好、稳定和易测序等的优点。其中基于随机引物PCR的分子标记，由于不需要合成特定引物就可以检测DNA的多态性，并且不依赖于基因组结构和种属特异性，现已在物种鉴别、遗传多样性分析、亲缘关系分析等研究领域得到了广泛应用。

虽然基于随机引物PCR的分子标记技术显示出了它独特的优越性，但目前尚未发现任何一种分子标记技术可以满足作为理想的遗传标记的所有要求。因此在实验过程中我们往往需要结合其他分子标记，使之可以快速构建高饱和度的遗传图谱。不过可以预见的是基于随机引物PCR的分子标记技术将在一定时期内得到长足发展，有一个更广阔的应用前景。

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