HPLC测定小花清风藤中齐墩果酸的含量

刘志海　黄沛　夏高春

【摘要】目的：建立小花清风藤中齐墩果酸的含量测定方法，为该药材控制种植、加工、应用提供的质量控制。方法：采用HPLC法，以甲醇-0.1mol/L乙酸铵（85∶15）为流动相，在波长210nm处检测小花清风藤中齐墩果酸的含量。结果：齐墩果酸在0.1989～1.2430mg/ml范围内呈良好的线性关系（r=0.9991，n=6）；加样回收率为 95.6%，RSD为0.6 %。结论：该方法简便、准确、灵敏、重复性较好，可用于小花清风藤的质量控制。

【关键词】 小花清风藤；高效液相色谱；齐墩果酸

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）19-0008-03

Abstract：Objective To establish a method to determine components in Sabia parviflora Wall. ex Roxb.，to improve its quality standard. And as the medicinal materials further to control the quality of the planting ang， processing， using the basis.Methods Using HPLC with the gradient elution of Methyl alcohol-0.1mol/L ammonium acetate solution（85∶15） detected the content of oleanolic acid at 210nm. Results Oleanolic acid showed a good linear range in 0.1989～1.2430mg/ml（r=0.9991，n=6） ， recovery was 95.6%；RSD was 0.6%.Conclusion The established method is simple， accurate， sensitive and， repeatability is good which， can be used for quality control of Sabia parviflora Wall. ex Roxb.

Keywords：Sabia Parviflora； HPLC； Oleanolic Acid

小花清风藤为清风藤科植物小花清风藤Sabia parviflora Wall. ex Roxb的茎和叶，俗称小黄药、黄肿药、黄眼药、雅希强，是布依族、苗族的常用药物。主要分布于云南、广西、贵州黔西南安龙、望谟、册亨、惠水等地[1]；小花清风藤味苦，性微寒，具有清热利湿，清肝利胆，祛风湿，消炎止痛的功效，临床用于治疗湿热黄疸，风湿骨痛，跌打损伤，肝炎。贵州少数民族用于治疗肝炎具有很好的疗效。《贵州植物志》记载，小花清风藤制成的冲剂对甲肝患者治疗的有效率达95%以上；对乙肝的治疗效果也较显著，其降黄疸和转氨酶的效果极佳，用药后约30%患者的表面抗原转阴。现代研究证明，小花清风藤具有保肝、治疗肝炎的作用[2]。小花清风藤收载于2003版《贵州省中药材、民族药材质量标准》，但标准仅有显微和理化鉴别。小花清风藤中含具有有护肝降酶的齐墩果酸[3-4]，研究在天然药物化学的基础上，结合小花清风藤的功能主治，建立HPLC法测定小花清风藤齐墩果酸含量的方法，旨在为苗药小花清风藤的资源开发及质量控制提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters e2695型高效液相色谱仪（含Empower色谱数据工作站）；AUY220万分子一电子天平（日本岛津）；赛多利斯CPA2250十万分子一电子天平；电热恒温干燥箱（上海博讯实验有限公司）。

1.2 材料 齐墩果酸对照品（批号110709-201206，中国药品生物制品检定所，含量94.9%）；小花清风藤采于贵州黔西南兴义市滴水村。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters SunFire C18 （5um 4.6×250mm）； 流动相：甲醇-0.1mol/L乙酸铵（85：15）；柱温：30℃；进样量：10μl；检测波长：210nm。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸52.39mg（含量94.9%），加甲醇定容至100ml量瓶中，制成每1ml含齐墩果酸0.4972mg的溶液，所得对照品图谱见图1。

2.3 供试品溶液的制备 取小花清风藤药材粉末4g，精密称定，加入70%乙醇50ml，水浴回流2小時，取出，放冷；再用70%乙醇补足减失的重量，过滤，精密取25ml滤液置于蒸发皿中，蒸干，残渣加3mol/L HCl 50ml使其溶解，加热回流3小时，然后用三氯甲烷振摇提取4次（每次15ml），合并三氯甲烷液，挥干，残渣加甲醇溶解，定容至10mL，摇匀，取续滤液，即得。所得供试品图谱见图2。

2.4 线性关系的考察 分别取齐墩果酸对照品4、8、10、15、20、25μl，按“2.1”项进行HPLC分析，以峰面积Y为纵坐标，进样浓度X为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y=4.67×106X-1.54×104，r=0.9991（n=6）。结果表明齐墩果酸进样量在0.1989～ 1.2430mg/ml 范围内与峰面积呈良好的线性关系。具体见表1、图3。

2.5 精密度试验 取齐墩果酸对照品（浓度为0.4792mg/ml）10μl，连续进样6次，在上述色谱条件下，测定齐墩果酸的峰面积。结果齐墩果酸峰面积的平均积分值为2373089，RSD=0.7%，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验 精密称取小花清风藤粉末（3号样大茎）6份，按“2.3”项操作，制备6份供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，记录峰面积，测定齐墩果酸含量。结果齐墩果酸峰面积RSD为2.8%，说明本方法重复性良好。

2.7 稳定性考察 取一份小花清风藤粉末（4号样大茎），按“2.3”项操作，制备供试品溶液，室温放置0、2、4、6、8、10h，按“2.1”项色谱条件测定，记录峰面积。结果齐墩果酸峰面积的RSD为2.5%，表明供试品溶液在10h内稳定。

2.8 加样回收率试验 称取已知含量的（3号样大茎）小花清风藤药材6份，每份约2g，分别加入10ml 0.4972mg/ml齐墩果酸对照品溶液，按2.3项方法进行样品处理后，按2.1项色谱条件测定，记录峰面积，测定齐墩果酸含量，计算加样回收率。由表2可知，齐墩果酸的平均加样回收率为95.6%，RSD为0.6%，表明本方法的准确度良好。

2.9 样品含量测定 分别称取6个批次的小花清风藤粉末，按“2.3”项操作，平行制备供试品溶液，按“2.1”项方法进行分析，记录峰面积，测定药材中齐墩果酸含量。结果见表3。

3 讨论

从表3可知，小花清风藤样品间齐墩果酸的含量存在一定差异，大茎叶中的齐墩果酸含量高于嫩茎嫩叶、小茎叶及中茎叶。药材的茎叶生长年限越长，齐墩果酸的含量越高。说明在药材选择时偏向生长年限长，茎叶粗大的较好。

结合参考文献[5]和齐墩果酸的化学特性，药材采用70%乙醇50ml水浴回流2小时，加3mol/L盐酸加热回流3小时，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷液，蒸干，甲醇定容。在吸收波长的选择上，参考文献[5-6]及通过DAD三微图谱扫描软件，齐墩果酸210nm波长处有较好吸收且杂峰较少基线较平，故选择210nm为吸收波长。

流动相选择时使用了甲醇-0.1mol/L乙酸铵（85∶15）、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（87∶13∶0.04∶0.02），两种流动相得到的齐墩果酸峰型都较好，供试品主峰都能与杂峰得到分离，因此参考2010版《中国药典》（一部）翼首草含量测定的流动相选择，故选择甲醇-0.1mol/L乙酸铵作为流动相。

综上所述，研究建立的HPLC测定小花清风藤中齐墩果酸的方法对齐墩果酸的分离较好，方法简单，灵敏，精确度高，可作为小花清风藤的质量控制指标。

参考文献

[1] 贵州省药品监督管理局. 贵州省中药材、民族药材质量标准[S].贵阳：2003：57.

[2] 刘易蓉，邱晓春，陈惠.小花清风藤保肝作用实验研究[J].中国药房，2008，19（30）：2341.

[3] 林材，梁光義.清风藤等中药化学成分的研究[D].贵阳：贵州大学，2006.

[4] 林佳，郝小江，梁光义，等.小花清风藤化学成分的研究[J].中草药，1999，30（5）：334-335.

[5] 刘易蓉，张永萍，梁光义，等.黔南小花清风藤中齐墩果酸的提取工艺[J].中国中药杂志.2006，31（16）：1373.

[6] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：358.

（收稿日期：2015.06.24）