三叶木通中酚醇和酚醇苷的生物活性研究

关树光　於文博　潘文君　修志儒

【摘要】目的：研究三叶木通茎中的四种酚醇和两种酚醇苷的抗氧化活性及抑制脂多糖诱导生成一氧化氮的活性。方法：通过对氧化自由基吸收能力（ORAC）荧光检测法测定化合物的抗氧化活性。利用脂多糖（LPS）诱导小鼠单核细胞RAW267.4产生一氧化氮（NO）的含量和细胞增殖检测法（MTT法），确定化合物抑制NO生成的作用。结果：三叶木通中的酚醇及酚醇苷类化合物（1～6）与阳性对照药维生素C（Vitamin C）相比，具有很强的抗氧化活性，其中酚醇类化合物（1～4）比酚醇苷类化合物（5～6）的抗氧化活性更强；化合物（1～6）均没有细胞毒作用；与阳性对照药N-单甲基-L-精氨酸（L-NMMA-a）相比，化合物（1～6）显示了中等抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的活性。结论：三叶木通茎中四个酚醇类和两个酚醇苷类化合物具有明显的抗氧化活性和对LPS诱导RAW264.7细胞生成NO的中等抑制活性。

【关键词】三叶木通；酚醇和酚醇苷；NO抑制活性；抗氧化活性

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】A 【文章编号】1007-8517（2015）23-0012-02

木通一词最早见于《药性赋》，在我国乃至其他亚洲国家广泛应用有近千年[1]。三叶木通Akebia trifoliata-（Thunb.） Koidz.是《中国药典》收载木通药材基源之一，具有祛心火、利尿、调经、催乳等功效，现代临床常用于抗感染、利尿。

1 仪器与材料

1.1 仪器 RF-5301 PC荧光分光光度计（日本岛津公司）；MCO-15AC培养箱（日本三洋公司）；MK3酶标仪（美国Thermo公司）。

1.2 药材 三叶木通于2011年5月采集自江西省武宁县九岭山，经长春中医药大学药学院姜大成教授鉴定为Akebia trifoliata-（Thunb.） Koidz，样品保存于长春中医药大学（样品编号：201108006）。

1.3 试药 96孔板（Perkin Elmert生物科学公司）；水溶性维生素E（Trolox）（美国Aldrich化学试剂公司）；维生素C（百灵威科技有限公司）；荧光素钠盐（Sodium Fluorescein，SF）（美国Sigma公司）；2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（AAPH）（美国Wako Pure化学公司）；脂多糖（LPS）（美国Sigma公司）。

2 方法与结果

2.1 化合物的提取与分离 三叶木通干燥茎，水加热提取，滤过，滤液减压浓缩，浓缩液经D-101大孔树脂柱层析，分别以水、20%乙醇洗脱。20%乙醇洗脱部分再经硅胶柱层析（氯仿- 甲醇4∶1～2∶1梯度洗脱），制备型高效液相纯化（甲醇∶水=10∶90～15∶85），共获得6个化合物。化合物（1～6）分别为4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲醇；赤式-1-苯-（4′-羟基-3′-甲氧基）-2-苯（4″-羟基-3″-甲氧基）-1，3-丙二醇）；苏式-1-苯-（4′-羟基-3′-甲氧基）-2-苯-（4″-羟基-3″-甲氧基）-1，3-丙二醇；（7S，8S）-1-（4-羟基-3，5-二甲氧基苯）-1，2，3 -丙三醇；2-（4-羟基-3-甲氧基苯）-乙醇1-β-D-葡萄糖苷；（7S，8S）-1-（4-羟基-3，5-二甲氧基苯）-1，2，3-丙三醇-2-β-D-葡萄糖苷。见图1[2]。

2.2 一氧化氮（NO）抑制活性测定 酚醇和酚醇苷类化合物（1～6）对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的抑制试验是通过测定脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞产生NO的量完成[3]。RAW264.7巨噬细胞加入改良Eagle培养基（DMEM）[含100U/ml青霉素及100-（g/ml链霉素和10%胎牛血清（FBS）]中，于37℃，在5% CO2培养箱中传代培养三代，取对数生长期细胞用于实验。

取对数生长期细胞于无酚红的10% FBS-DMEM培养液中，调整细胞浓度为2×10.5 /ml，接种于96孔板中继续培养24h后，细胞用磷酸缓冲液（PBS）洗涤，更换新培养液，并加入4μg/ml LPS刺激细胞20h，收集细胞培养液，采用Griess法，通过测定反应生成的亚硝酸盐含量的方法间接测定NO产生量。将180μl Griess试剂[0.1% N-（1-萘基）乙二胺盐酸盐水溶液和1%磺胺5%磷酸溶液，体积比1∶1]加入每100μl经LPS和待测化合物处理过的96孔板细胞上清液中。上述实验平行做三次。L-NMMA-a-（N-单甲基-L-精氨酸）作为阳性对照药[4]。

化合物（1～6）对LPS诱导的RAW264.7细胞的细胞毒作用也按照文献方法[5]进行测定，以避免细胞毒作用对化合物抑制iNOS的影响。

2.3 抗氧化能力指数（ORAC）测定 抗氧化能力指数测定应用了Cao等报道的稍改良的ORAC测定法[6-7]。170μl R-藻红蛋白（R-PE）溶解于PBS并置于96孔板中，37℃预培养15min后，加入10μl空白对照PBS，阳性对照水溶性维生素E（Trolox）或化合物样品，浓度为500、50、5、0.5、0.05μM，再加入20μl 2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（AAPH）后开始反应，反应液终浓度分别为R-PE 4μg/ml、Trolox 2.5μM，AAPH 12mM。维生素C用做阴性对照。上述实验平行三次。75min内，荧光（激发波长530nm，发射波长590nm）每5min记录一次，结果按下式计算：

S=（0.5+f5/f0+f10/f0+f15/f0+···i···F65/f0 + f70/f0 + f75/f0）×5

（f0 是初始荧光；fi是时间i时的实测荧光）

[（ORAC值（M）=2.5×K ×（S样品-S空白）/（S维生素E-S空白）K是指样品稀释因子]

2.4 统计学方法 数据采用 SPSS 11.0 统计软件进行处理，采用Student′s t、t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2.5 结果

2.5.1 抑制脂多糖诱导的NO产生活性 由表1可知，化合物（1～6）具有中等抑制LPS诱导产生NO的活性，其中化合物（1～4）与化合物（5～6）比较作用较明显。且化合物（1～6）均没有细胞毒作用。

2.5.2 抗氧化活性 通过ORAC法测定化合物的抗氧化活性，结果表明化合物（1～6）均具有很强的抗氧化活性。见图。

3 讨论

一氧化氮是一种很强的信号分子，存在于心血管系统、神经系统乃至全身，可以透过细胞膜并传递特定的信息或生物信号以调整细胞的活动，帮助机体完成特定的功能。NO可与超氧阴离子反应生成过氧化亚硝基阴离子，后者是强氧化剂，可造成细胞脂质过氧化、蛋白质酪氨酸硝基化、巯基氧化等，介导多种疾病的发生。三叶木通的酚醇及酚醇苷类化合物在体内外均有显著药理活性。

研究发现，三叶木通中的酚醇及酚醇苷类化合物（1～6）通过抑制LPS诱导的RAW264.7细胞产生NO的生成，抑制炎症反应。通过应用MTT法测定了化合物（1～6）的细胞毒作用，以排除因化合物本身的细胞毒作用而干扰化合物对NO产生抑制活性的测定。结果表明所测化合物均没有细胞毒作用，NO产生抑制活性结果可以直接反映被测化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞产生NO的活性。同时，酚醇类化合物（1～4）比酚醇苷类化合物（5～6）具有更强的抗氧化活性。证实了三叶木通中提取的六种酚醇及酚醇苷类化合物具有抑制NO生成的作用并对由NO诱发的多种疾病具有显著的防治作用，也为酚醇及酚醇苷类化合物提供了药效物质基础；为提升药材饮片、中成药的质量控制提供了科学依据。

参考文献

[1]梁永红.三叶木通资源和质量分析研究[D].北京：北京中医药大学，2006.

[2]关树光，於文博，关树宏.三叶木通中酚醇及酚醇苷类化学成分的研究[J].时珍国医国药，2010，21（4）：905-906.

[3]Han AR， Kang YJ，Windono T，et al.A new antifouling hexapeptide from a Palauan sponge， Haliclona sp[J].Journal of Natural Products，2006；69：719-721.

[4]李岩，邝枣园，李明，等.黄芩苷对脂多糖诱导巨噬细胞一氧化氮和一氧化氮合酶表达的影响[J].广东医学，2010，31（6）：675-677.

[5]Liu WJ， Jiang JF， Xiao D，et al.Down-regulation of telomerase activity viaprotein phosphatase 2A actvation in salvicine-indulde human leukemia HL-60 cell apoptosis[J].Biochem Pharmacol，2002；64：1677-1678.

[6]Cao G，Prior RL.Measurement of oxygen radical absorbance capacity in biological samples[J].Methods Enzymol. 1999，299：50-52.

[7]廖晖，梁红萍，武晋.红花的抗氧化活性及对-葡萄糖苷的作用研究[J].时珍国医国药，2013，24（9）：2131-2133.

（收稿日期：2015.08.28）