基于新靶点的抗真菌药物研究进展

黄鑫 刘颖 陈思敏 安毛毛 姜远英，2

(1.同济大学附属第十人民医院，上海200072;2.第二军医大学药学院，上海200433)

20世纪80年代以来，由于免疫抑制剂的广泛使用、广谱抗生素的长期应用、以及艾滋病和癌症放疗化疗患者的日益增多等现实问题，致使侵袭性真菌感染发病率逐年攀升［1］。目前，临床抗真菌药物大致分为四类:氮唑类、多烯类、棘白菌素类和氟胞嘧啶类。现有抗真菌药物普遍存在如抗菌谱窄、副作用大等局限性，导致其临床应用受限。因此，研究与开发新型抗真菌药物无疑将成为解决此类难题的重要希望。本文聚焦于抗真菌药物近年研发成果，集中论述了四类将要或已经进入临床试验阶段的新靶点药物。

1 抑制真菌细胞壁合成的药物

细胞壁作为真菌重要组成结构，不仅参与维持菌体完整性、平衡细胞内外压力、提供与宿主相互作用界面，还在真菌黏附及生物被膜形成中起重要作用。真菌细胞壁主要由多糖 (甘露聚糖、葡聚糖和几丁质等)及蛋白质组成，其中，碳水化合物约占细胞壁干重80%～90%，促进细胞壁生长的酶、结构蛋白及胞外酶等约占10%～20%，其余为类脂、无机盐等小分子物质。真菌细胞壁中，β-1，6-葡聚糖与几丁质通过β-1，3-葡聚糖还原末端连接形成三维网络结构，此外，某些β-1，6-葡聚糖也可直接与几丁质相连。细胞壁蛋白中，糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白与内部重复蛋白 (Pir蛋白)分别通过 β-1，6-葡聚糖及 β-1，3-葡聚糖共价连接于真菌细胞壁多糖骨架上，其余为非共价连接的细胞壁蛋白［2］。由于哺乳动物细胞没有细胞壁，因此细胞壁成为备受瞩目的抗真菌靶点。

1.1 以Gwt1p为靶点的E1210

2011年，日本卫材公司合成小分子化合物E1210(见图1)［3-10］。真菌GPI锚定蛋白通过GPI结构锚定于细胞壁多糖骨架上。E1210通过抑制Gwt1p(GPI锚定蛋白合成过程中参与肌醇酰化反应的酶)活性，抑制GPI锚定蛋白合成，进而减少GPI锚定蛋白含量，抑制细胞壁甘露糖蛋白层对多糖骨架的附着，最终抑制真菌生长［10］。体外实验结果表明，E1210可抑制念珠菌 (MIC50≤0.016 μg/mL)、曲霉菌 (MIC50=0.030 μg/mL)、镰刀菌(MIC50=0.060 μg/mL)等真菌生长［9-10］;体内实验结果表明，E1210可提高感染播散性念珠菌病小鼠生存率60%、播散性镰刀菌病小鼠生存率80%、播散性耐棘白菌素白念珠菌病小鼠生存率40%［3，10］。尽管哺乳动物基因PIGW与GWT1同源，但两者仅28%相同，故E1210对人体细胞毒性较小(IC50＞32 μg/mL)［4，9］。目前，E1210 治疗侵袭性耐药菌感染的药代动力学、药效动力学分析及临床试验评价正在进行中。

1.2 以Kre6p为靶点的D11-2040

2010年，Kitamura等［11］合成小分子化合物D11-2040(见图2)。真菌细胞壁GPI锚定蛋白通过β-1，6-葡聚糖锚定于β-1，3-葡聚糖及几丁质上。D11-2040可通过抑制β-1，6-葡聚糖合成酶Kre6p的活性，抑制β-1，6-葡聚糖合成，直接破坏真菌细胞壁结构;此外，破损的真菌细胞壁可导致某些细胞壁蛋白(如与真菌黏附，菌丝生长，生物被膜形成有关的Hwp1p、Als1p等)附着减少，降低真菌致病力。体外实验结果表明，D11-2040对光滑念珠菌 (0.032 μg/mL≤MIC50≤0.125 μg/mL)、克柔念珠菌 (0.500 μg/mL≤MIC50≤1.000 μg/mL)、近平滑念珠菌 (MIC50=0.008μg/mL)等真菌生长抑制作用良好［11］。体内实验结果表明，D11-2040(20 mg/kg)与氟康唑(FLC)合用对播散性白念珠菌感染小鼠治疗作用优于FLC单用(感染后第7天，生存率提高75%)。由于哺乳动物无KRE6同源基因，故D11-2040潜在细胞毒性较小［D11-2040前体化合物 D75-4590(Kre6p抑制剂)GI50＞16μg/mL［12］］。目前，对 D11-2040与 FLC 合用的体内抗菌作用机制研究正在进行中［11］。

2 抑制蛋白激酶或蛋白磷酸酶信号通路的药物

作为真核生物，真菌拥有类似哺乳动物的信号转导通路。蛋白激酶与蛋白磷酸酶作用相反，分别控制底物磷酸化及去磷酸化，对真菌信号转导及调控起重要作用。因此某些抑制真菌蛋白激酶或蛋白磷酸酶信号通路的化合物，具有抗真菌作用。

2.1 以Pkh1/2激酶为靶点的KP-372-1

2011年，Krysan等［13］发现处于早期临床试验阶段的抗癌化合物KP-372-1(哺乳动物细胞PDK1/Akt抑制剂)可抑制真菌Pkh1/2激酶活性，产生抗真菌作用 (见图3)。真菌Pkh1/2激酶与哺乳动物PDK1高度同源，Pkh1/2激酶磷酸化可激活下游激酶活性 (包括ACG家族激酶Ypk1/2p、Sch9p、Pkc1p 等)，其中 Ypk1/2 和 Pkc1p 激酶与真菌细胞壁完整性及CWI信号通路 (胞壁完整性信号通路:MAPK信号通路之一，能检测真菌细胞在正常生长或环境变化时产生的胞壁胁迫信号并及时作出应答，参与细胞壁的合成、分泌等一系列生理调控)激活有关。Pkh1/2激酶被KP-372-1抑制后，真菌细胞壁损伤、CWI信号通路阻断，真菌死亡［14］。体外实验结果表明，KP-372-1可抑制白念珠菌 (MIC=3.0μg/mL)、光滑念珠菌 (MIC=3.0 μg/mL)、新生隐球菌 (MIC=3.0 μg/mL)、近平滑念珠菌 (MIC=12.5 μg/mL)等真菌生长［13］。此外，KP-372-1无显著细胞毒性，对人蛋白激酶有高度选择性，人体正常细胞对其耐受性良好 (IC50=0.838 μmol/L)［15］。该化合物体内抗菌活性评价暂未见报道。

2.2 以Hsp90为靶点的17-AAG和Mycograb

2009年，Cowen 和 Lindquist等［16］发现处于Ⅱ期临床试验阶段的抗肿瘤化合物17-AAG(见图4)可抑制真菌 Hsp90活性，产生抗真菌作用。Hsp90是一组高度保守的分子伴侣，与辅分子伴侣结合后，激活钙调神经磷酸酶信号通路，对抗药物引起的真菌细胞膜和细胞壁损伤，在多种真菌耐药性成因中起重要作用。17-AAG竞争性结合Hsp90 N-末端ATP结合位点，抑制Hsp90的分子伴侣功能，阻断真菌耐药信号通路，产生抗真菌作用［17］。体外实验结果表明，17-AAG(5μmol/L)可增强两性霉素B对两性霉素B耐药土曲霉菌 (MIC=1.000μg/mL)、两性霉素B敏感土曲霉菌 (MIC=0.125μg/mL)、两性霉素B敏感烟曲霉菌 (MIC=0.190μg/mL)的抑制作用［18］。体内实验结果表明，17-AAG与两性霉素B合用可降低两性霉素B耐药土曲霉菌感染小鼠肺部载菌量 (CFU降低66.7%)［18］;与FLC合用可使感染白念珠菌的大蜡螟幼虫存活率提高95%［16］。由于17-AAG对癌细胞Hsp90的亲和力比正常细胞高100倍，因此17-AAG对哺乳动物正常细胞毒性较小 (IC50＞5 μmol/L)［19-20］。目前，该化合物与两性霉素B的进一步体内协同研究正在进行中。

2006年，诺华公司完成对Mycograb的临床Ⅲ期实验评价［21］。Mycograb为一段28 kD的重组单克隆抗体片段，通过半胱氨酸及连接元件将人源抗Hsp90抗体重链和轻链的可变域结合起来［22］。Mycograb通过与 Hsp90表位 NKILKVIRKNIVKK结合，抑制Hsp90活性，产生抗真菌作用。体外实验结果表明，Mycograb与两性霉素B合用，对 FLC敏感白念珠菌 (FICI=0.09)、FLC耐药白念珠菌(FICI=0.27)、克柔念珠菌(FICI=0.28)、热带念珠菌 (FICI=0.16)、光滑念珠菌(FICI=0.31)等均具有协同抗真菌作用［23］。体内实验结果表明，Mycograb与两性霉素B脂质体合用同两性霉素B脂质体单用相比，降低侵袭性念珠菌病患者死亡率4倍以上;提高整体临床应答率36%;提高真菌清除速率2倍以上。临床上，患者对Mycograb耐受性良好，副作用发生率仅为10%［21］。尽管由于不同生产批次间抗体结构存在差异，导致该药物的欧洲上市申请被驳回，但对其改造药物的研究正在进行中。

3 靶向真菌毒力因子的单克隆抗体

真菌毒力因子包括在真菌感染过程中直接导致宿主病理损伤的因子;与毒力因子表达及功能发挥相关因子;促进真菌在宿主体内定植，逃避宿主免疫，促进胞内生存或者募集宿主因子促进病原菌存活的相关因子等。真菌毒力因子常通过黏附、形态转换、分泌色素、增加耐药性等作用，使真菌产生致病性。因此，靶向真菌毒力因子的单克隆抗体，可能具有抗真菌活性。

3.1 以Als3p为靶点的C7

2003～2011 年间，Pontón 等［24-27］陆续发表文章宣布单克隆抗体C7通过抑制Als3p活性产生抗白念珠菌作用。与真菌黏附和毒力密切相关的一类细胞壁蛋白为Als蛋白。Als3p为Als蛋白家族成员，介导真菌对上皮细胞、内皮细胞及细胞外基质蛋白的黏附;生物被膜的形成;与E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白结合，介导真菌对宿主细胞的侵袭;与铁蛋白结合，为真菌生长提供铁离子。C7可与真菌Als3p N端特异性结合，阻碍Als3p与铁蛋白结合，进而抑制铁离子的摄取，产生杀菌作用［26-27］。体外实验结果表明，C7对白念珠菌、葡萄牙念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉菌、多育赛多孢子菌等真菌生长具有抑制作用 (抑制率 34.2% ～88.7%)［24］。体内实验结果表明，C7可提高播散性念珠菌感染小鼠生存率25%［25］。因哺乳动物细胞不含 Als蛋白，故C7对哺乳动物细胞潜在毒性较小 (C7总用药量达400μg时，小鼠对其耐受性良好)。目前，对单克隆抗体C7体内治疗作用的进一步评价正在进行中。

3.2 以葡萄糖醛酰木糖基甘露聚糖 (GXM)为靶点的213Bi-18B7和188Re-18B7

电离辐射可快速高效杀死病原微生物，目前已广泛应用于医疗器械及食品消毒，然而该技术在抗真菌疗法中尚未普及。一种新型抗真菌药物研发思路是将放射源靶向导入至宿主体内感染部位，既可有效治疗真菌感染，又可减少对机体的毒副作用，至此，放射免疫疗法应运而生。2003～2012年，Dadachova等［28-30］陆续报道应用213Bi-18B7 和188Re-18B7放射免疫疗法治疗新生隐球菌感染。新生隐球菌侵袭宿主时，产生大量荚膜多糖，干扰宿主免疫防御，如:抑制白细胞迁移、细胞因子异常调节、抑制吞噬作用、诱导T淋巴细胞分泌免疫抑制分子等。单克隆抗体18B7可特异性结合新生隐球菌GXM(荚膜多糖主要成分)，通过调理素作用，介导抗原-抗体复合物被宿主细胞摄取，减少血液中毒力因子［31］;同时，放射性同位素213Bi和188Re分别释放α和β粒子，对真菌产生细胞毒性辐射。腹腔注射100μCi213Bi-18B7提高系统性新生隐球菌感染小鼠生存率60%，100μCi188Re-18B7提高40%［28］，且213Bi-18B7体内抗菌效果优于两性霉素B［29］。此外，213Bi-18B7 和188Re-18B7 无显著细胞毒性，治疗浓度为100μCi时，小鼠正常细胞对其耐受性良好。目前，对213Bi-18B7和188Re-18B7的抗菌谱评价正在进行中，其在人体中作用有待进一步研究。

4 激活宿主免疫系统的疫苗

控制真菌感染的手段之一是预防。真菌菌体内的糖类和蛋白质等物质，可作为抗原，刺激机体产生相应抗体，在宿主免疫系统抗真菌过程中起重要作用。因此，以真菌抗原成分为基础研发出的疫苗接种于机体后，可使机体产生免疫力，有望保护患者免受真菌感染。目前，以接种疫苗的方式预防真菌感染，已成为对抗真菌感染的新策略。

4.1 以Sap2为靶点的PEV7

2012年，瑞士Pevion Biotech公司研发出白念珠菌rtSap2与人工合成的流感病毒H1N1包膜构成的重组蛋白疫苗 PEV7［32］。Sap为一类酸性可溶性蛋白酶，是白念珠菌重要毒力因子。其家族成员Sap2为念珠菌性阴道炎的重要致病因素。白念珠菌可通过Sap2降解宿主细胞外基质、纤维连接蛋白、免疫球蛋白等达到获取营养、免疫逃逸、促进定植的目的。已证明Sap2可诱导B细胞产生抗体，发挥体液免疫作用，因此，Sap2便成为白念珠菌的潜在抗原靶点。PEV7可通过其H1N1包膜组件的细胞膜融合效应，如HA(Hemagglutinin，血凝素蛋白:流感病毒H1N1包膜表面糖蛋白)介导的pH依赖性膜融合效应等，将结合于H1N1包膜表面的rtSap2(Sap2片段)递呈给抗原提呈细胞，刺激宿主细胞产生抗Sap2 IgG和IgA，激活宿主免疫系统清除病原体。体内实验结果显示，PEV7免疫大鼠阴道念珠菌清除速率显著加快(感染后1～21 d内，CFU降低10%～40%)。此外，用含50 mμg(1 mμg=1×10-9g)rtSap2、10 mμg HA 的 PEV7接种大鼠，每周1次，连续接种4周，结果表明该疫苗对大鼠无显著毒性影响。目前，该疫苗正处于临床Ⅰ期实验阶段［32］。

4.2 以 β-1，2-甘露三糖［β-(Man)3］、果糖二磷酸醛羧酶 (Fba)多肽片段为靶点的β-(Man)3-Fba-TT

2012 年，Hong Xin 等［33］研发出 β-(Man)3、Fba多肽片段、灭活破伤风类毒素 (TT)组成的结合疫苗β-(Man)3-Fba-TT。β-(Man)3和 Fba均为白念珠菌表面抗原。尽管多糖表位可被B、T细胞受体识别，但只有多肽抗原才可被组织相容性复合体(MHC)分子递呈给T细胞。蛋白与多糖结合后，免疫系统可大量识别真菌细胞壁多糖成分，增加抗体对病原体识别率。疫苗β-(Man)3-Fba-TT将多糖β-(Man)3与蛋白Fba相结合，组成的糖肽抗原β-(Man)3-Fba可被MHC分子递呈给B、T细胞，刺激释放IgM、IgG1、IgG2a，激活宿主免疫系统清除病原体。体内实验结果显示，β-(Man)3-Fba-TT免疫小鼠感染播散性念珠菌病的存活率显著提高 (存活率100%)、肾脏载菌量显著降低 (CFU降低72%)。鉴于β-(Man)3-Fba-TT的良好体内效果，该疫苗有望应用于临床［33］。

5 其他抗真菌药物

由于新药研发成本高，联合用药已成为治疗真菌感染的新思路。研究表明，一些本身不具有抗菌活性或抗菌活性较低的化合物与临床常用药物合用后，不但显示出抗菌增效作用，还可减少药物用量、降低毒副作用。2006年，作者所在课题组广泛筛选具有抗真菌活性的中药提取物及中药单体化合物，首次报道盐酸小檗碱 (BBR)(见图5)与FLC(见图6)合用具有协同抗耐药白念珠菌作用［34］。小檗碱在我国应用历史悠久，过去主要用于清热解毒和治疗细菌性腹泻，其不良反应及毒副作用少见，疗效及安全性均得到普遍认可。体外实验结果表明，单用BBR对白念珠菌有微弱的抑菌作用(MIC≥125μg/mL);BBR与FLC合用后，对实验室诱导耐药白念珠菌Candida albicans Resis-Y01(FICI=0.066)、Candida albicans Resis-Y01023(FICI=0.063);临床耐药白念珠菌 Candida albicans 0305148(FICI=0.071)、Candida albicans 0305116(FICI=0.078)等均具有良好协同抗真菌作用。体内实验结果表明，9.0 mg/kg BBR与0.5 mg/kg FLC合用，可使系统性 Candida albicans 0304103感染小鼠平均存活时间延长至18.7 d，是9.0 mg/kg BBR 单用时存活时间的 5.34 倍、0.5 mg/kg FLC 单用时的 1.89 倍［35］。本课题组通过蛋白质组学和基因组学等研究，提出如下机制假说:白念珠菌通过胞吞作用将BBR转运至空泡中贮存以产生BBR耐药现象;当BBR与FLC合用时，FLC可破坏空泡膜释放BBR，BBR通过增强三羧酸循环、抑制线粒体ATP合酶活性等途径导致菌体内ROS大量生成，同时引发真菌DNA损伤，最终产生协同抗耐药真菌作用［36-37］。目前，对BBR与FLC协同抗耐药真菌机制的后续验证工作正在进行中。

图1 E1210的化学结构 图2 D11-2040的化学结构 图3 KP-372-1的化学结构 图4 17-AAG的化学结构 图5 BBR的化学结构图6 FLC的化学结构Fig.1 The structure of E1210 Fig.2 The structure of D11-2040 Fig.3 The structure of KP-372-1 Fig.4 The structure of 17-AAG Fig.5 The structure of BBR Fig.6 The structure of FLC

此外，其他基于新靶点的抗真菌前药正不断涌现，如:以 Upc2转录因子为靶点的VB00075177［38］;以 C-14 还原酶为靶点的 1b［39］;以26s 蛋白酶体为靶点的 fellutamides［40］;以亮氨酰tRNA合成酶为靶点的AN2690等［41］。这些抗真菌前药有望改善现有治疗方法，为未来临床研究奠定基础。

6 展 望

利用宿主与病原体蛋白结构差异，研发可选择性识别真菌靶蛋白且毒性较低的化合物，是研发新靶点抗真菌药物的重要策略。计算机辅助设计、基因组学和蛋白质组学等技术的日趋成熟，有助于推动新靶点抗真菌药物研发。寻找新的能协同现有抗真菌药物发挥抗耐药真菌的活性的新化合物值得关注。从中药资源中寻找抗真菌中药或中药成分也可能发现有效的抗真菌新药。

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