iTRAQ技术在真菌研究中的应用进展

刘原志 章强强

(复旦大学附属华山医院皮肤科真菌室，上海200040)

同位素标记相对和绝对定量技术 (isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)是美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)在2004年推出的一项功能强大的多肽体外同位素标记技术［1］。该技术采用4种或8种同位素编码的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团及串联质谱分析，可以同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对水平。自2004年推出以来，该技术已被应用于细菌、真菌、人体组织及体液等多种样本的蛋白质鉴定和定量，在信号转导及翻译后修饰研究、基因与蛋白质表达相关分析和细胞膜与亚细胞结构分析等生命科学领域的应用也得到了广泛关注。在iTRAQ四标试剂基础上，2007年ABI公司又推出了iTRAQ八标试剂，进一步增加了检测样本的通量［2］。

真菌的致病作用是多种蛋白质共同参与下的真菌-宿主相互作用的复杂过程，因此整体、定量地分析真菌致病过程中的差异表达蛋白质谱，对于研究真菌的致病机制具有重要作用。包括iTRAQ技术在内的比较蛋白质组学方法着重于筛选不同样本之间的差异蛋白质谱，揭示细胞在生理及病理不同状态下的生物进程变化，获得对某些关键蛋白质的定性、定量和功能信息［3］，在真菌致病性及疾病早期诊断等方面具有重要的应用价值。本文对iTRAQ技术在真菌研究中的应用进展作一综述。

1 iTRAQ技术介绍

1.1 iTRAQ技术基本原理

iTRAQ技术是一种新的、功能强大的可以同时比较4种或8种不同样品中蛋白质相对含量或绝对含量的方法，这种方法是建立在iTRAQ试剂基础上的［4］。iTRAQ试剂是一种小分子同重元素(isobaric)化学物质，它包括三个部分:一端为报告基团(reporter group)，中间为平衡基团 (balance group)，另一端为肽反应基团 (peptide reactive group)。iTRAQ四标试剂是由4种相对分子质量分别为114、115、116和117的报告基团，相对分子质量分别为31、30、29和28的平衡基团及一个相同的肽反应基团组成。不同的报告基团分别与相应的平衡基团相配后，相对分子质量均为145，即等量异位标签。而iTRAQ八标试剂是由8种相对分子质量均为305的等量异位标签分子组成，标签分子由相对分子质量分别为 113、114、115、116、117、118、119和121的报告基团，相对分子质量为192、191、190、189、188、187、186 和 184 的平衡基团，以及一个相同的氨基酸特异性多肽反应基团组成［5］，由于苯丙氨酸的质荷比为120，为了避免对质谱鉴定结果造成干扰，八标试剂中的报告基团中缺少120。

肽反应基团将iTRAQ标签与肽段的N-端基团和每个赖氨酸侧链相连，可以标记所有的酶解肽段。平衡基团保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷比相同，因此无论哪一种iTRAQ试剂标记样本，在第一级质谱检测中，不同样本中的相同蛋白质表现为同一质荷比。用串联质谱方法对第一级质谱检测到的前体离子 (Precursor ion)进行碰撞诱导解离，产物离子通过二级质谱进行分析。在二级质谱过程中，标记多肽分解为报告基团、平衡基团及氨基酸。报告基团在MS/MS图上表现为诊断离子(Diagnostic ion)，为iTRAQ技术蛋白质定量的关键，其峰高和面积代表了不同样本中同一蛋白质的相对丰度。同时多肽的酰胺键断裂，形成一系列y-离子和b-离子，通过查询数据库可以鉴定出相应的蛋白质前体。

1.2 iTRAQ技术操作流程

以两个样本为例，iTRAQ技术大致流程如图1所示，样品经过还原烷基化、胰蛋白酶酶解得到肽段。将肽段用iTRAQ试剂标记，再将标记样本混合，最后用LC-MS/MS进行分析。每一个iTRAQ实验可得到数千个可识别的多肽和上百个可鉴定的蛋白质。因此，生物信息学的工具和方法对于分析这些数据必不可少。iTRAQ制造商提供的软件如Pro Quant、Protein Pilot等可用于分析这些蛋白质组学数据［6］。其他软件如 Shadforth［7］开发的 i-Tracker等也可用于数据分析及解释。

图1 iTRAQ技术操作流程Fig.1 Overview of iTRAQ reagents methodology

1.3 iTRAQ技术的优缺点

目前，蛋白质组学研究中应用比较成熟的定量方法主要有两种:一种基于传统双向凝胶电泳及染色，另一种基于质谱检测技术［8］。目前应用比较广泛的双向电泳技术主要是双向荧光差异凝胶电泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE)。与传统双向电泳技术相比，2D-DIGE虽然准确性和重复性更高，但仍不能克服双向电泳本身的缺陷，如:操作繁琐;难以与质谱直接联用，自动化程度低;对于低丰度蛋白、极大蛋白(相对分子质量＞200 kD)、极小蛋白 (相对分子质量＜8 kD)、极碱性蛋白和疏水性蛋白等难以进行有效分离，限制了其应用范围。

基于质谱的蛋白质组学定量技术可以分为标记定量技术和非标记定量技术两大类。标记定量技术可通过使用代谢标记、同位素编码亲和标签(isotope-coded affinity tags，ICAT)和在培养过程中使用稳定性同位素标记的氨基酸(stable isotope labeling of amino acids in culture，SILAC)等来区别两种不同样品的蛋白质，再通过质谱进行分析比较。其中ICAT技术目前已得到较广泛的应用，可以精确的分析两种不同样品蛋白质表达的差异。其缺陷为:依赖亲和素色谱柱可能由于低色谱容量导致样品损失或不可逆的非特异性结合造成样品污染;只能标记含有半胱氨酸残端的蛋白质，那些在功能上有重要作用但不含半胱氨酸的蛋白质将被遗失［9］。

iTRAQ技术作为一种新的蛋白质定量技术，比较于传统技术，其优点为:①由于iTRAQ试剂可以与肽段的N-端基团和赖氨酸侧链相连，因此几乎样本中的所有蛋白质均可被标记，包括双向电泳技术不能检测的蛋白质，如膜蛋白、疏水蛋白等以及ICAT技术不能标记的含有半胱氨酸的蛋白质［10］。由于每种蛋白质有更多的肽段可被分析，提高了蛋白质鉴定的覆盖率和可信度。②可以同时对多达8个样本中的蛋白质进行定量比较，能够对正常与疾病、治疗前后、疾病过程、细胞培养等不同状态下蛋白质定性和定量的表达差异进行研究。③iTRAQ试剂可以标记修饰后的氨基酸，因此可以对磷酸化蛋白、糖基化蛋白等翻译后修饰蛋白进行定量和定性研究，从中可以获得更为详尽的样品信息。④iTRAQ试剂的报告离子为小分子物质，因此在质谱图中很容易与其他多肽片段离子区分，保证了定量的准确性。⑤标记过程更简单，质谱检测更为灵敏［11］。

同其他蛋白质组学技术一样，目前iTRAQ技术仍存在一些缺陷:数据复杂度高，因此需要开发更多的信息学工具;iTRAQ试剂几乎可以与样本中的所有蛋白结合，容易受样本中的杂质蛋白及样本处理过程中缓冲液的污染，需要对样本进行预处理;iTRAQ试剂仍非常昂贵，这也一定程度上制约了它的广泛应用［12］。

2 iTRAQ技术在真菌研究中的应用

目前蛋白质组学在医学真菌学中的应用主要集中于对某些真菌双相性的了解、宿主反应、细胞壁、毒力因子、药物抵抗等方面，为了解真菌病发病机制和药物开发等打下了基础［13］。运用iTRAQ技术动态、定量地分析真菌生理、病理不同状态下蛋白质的差异表达谱，对于分析真菌的致病机制，探讨真菌与宿主的互相作用及寻找新的药物靶标具有重要作用。

2.1 在曲霉研究中的应用

为了研究卡泊芬净 (Caspofungin)对烟曲霉(Aspergillus fumigams)药物作用潜在的生物标记，Cagas等［14］用iTRAQ技术比较了药物作用前后烟曲霉蛋白质表达谱的差异，结果显示在可溶性和细胞壁/细胞质膜的蛋白质中有471个蛋白呈特异性表达。此外，总计有122个蛋白的差异表达水平至少超过2倍，其中线粒体缺氧反应蛋白的差异表达水平达 16倍以上。Sunil等［15］运用 iTRAQ结合LC-MS/MS技术进行了黑曲霉 (Aspergillus niger)及其在不同pH条件下突变体的分泌蛋白质组学研究。结果共鉴定了102个蛋白质，包括许多水解酶，如纤维素酶、半纤维素酶、过氧化物酶等。研究同时发现，特定的酶产物可以通过控制培养基的pH值变化获得。

2.2 在隐球菌研究中的应用

为了找出与生物膜现象相关的生物信号分子，从分子水平阐明隐球菌生物膜的发生及发展机制，贾红玲［16］从新生隐球菌生物膜状态与悬浮状态细胞外泌蛋白方面进行iTRAQ比较蛋白质组学研究。研究共发现3种差异蛋白分别为:FIP-FVE、Cation-transporting atpase及 Zincmetallopeptidase mde10，其中FIP-FVE是近年来从一些高等担子菌子实体中提取的与植物凝集素和免疫球蛋白的结构和功能相似的一类小分子蛋白质，其余两种在真菌蛋白数据库中的信息还未发现，具体的功能可能需要参照其他物种的生物学功能。腐殖隐球菌(Cryptococcus humicola)是一种具有高度铝耐受性的真菌，为了解其铝耐受性的遗传基础，Jingjing Zhang等［17］运用iTRAQ技术对腐殖隐球菌经过铝应力影响前后的蛋白质学变化作了研究。共鉴定了625个蛋白质，其中59个显著差异蛋白具有统计学意义。随后进行蛋白质功能研究发现29个上调蛋白主要参与翻译、核糖体结构构成和生物合成等，而30个下调蛋白主要参与了能量代谢、翻译后修饰等。这些功能性的改变有利于保护细胞免受铝毒性损害。

2.3 在镰刀菌研究中的应用

Rebecca等［18］应用 iTRAQ技术研究了禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)在侵犯宿主初期合成并分泌真菌毒素时的蛋白质水平变化，数据经筛选过滤发现共有435个显著差异表达蛋白，其中有72个上调蛋白。这些上调蛋白经过2-D PAGE/MS/MS鉴定，结果与iTRAQ所得结果一致。随后通过RT-PCR和Northern印迹杂交验证发现，这些上调蛋白的编码基因在真菌毒素合成期转录活性增高。Amalia等［19］用尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的小分生孢子感染蜡螟幼虫——一种检测固有免疫的无脊椎动物模型，结合iTRAQ技术分别研究在25℃和37℃时控制组和幼虫免疫组的差异表达蛋白。共鉴定得到超过50个差异表达蛋白，其中有17个可能与免疫相关，且当温度从25℃升高到37℃时，一些蛋白表达明显上调。通过生物信息学分析表明，这些免疫相关差异表达蛋白参与转运、免疫应答、氧化还原、分解代谢等进程。

2.4 在其他真菌研究中的应用

Ross等［1］于 2004年率先用 iTRAQ-MS/MS 技术比较了野生型啤酒酵母和两种基因缺陷型突变体的蛋白质组，证明该技术不仅可以提高蛋白质组表达差异分析的覆盖率，而且可以改善肽链断裂模式。Debra等［20］应用iTRAQ技术分析了两株不同基因型的酿酒酵母在葡萄酒发酵过程中3个不同时间点的蛋白质组学差异，并进行了gene ontology(GO)分析。结果表明随着时间的变化菌株之间的蛋白差异与代谢酶及其相关基因变化密切相关，同时对两菌株不同表现型的分子起源提出了假说。含油酵母(Oleaginous yeast)细胞内脂质积累的特性已被广泛研究用于生物能源领域。为了研究含油酵母高脂质聚集的机制，Jiahua Shi［21］等应用ITRAQ及LC-MS/MS技术对一株非含油酿酒酵母及两株含油酵母进行蛋白质组学研究。在早期、中期、晚期脂质积聚阶段，分别有132个、122个及116个蛋白质被鉴定，并成功检测到脂质合成及调控的相关必需蛋白。毕赤酵母表达系统是通用的、高效的外源蛋白表达系统，广泛地应用于生产和表达各种外源蛋白。Xiao-qiong Lin等［22］通过iTRAQ技术对3个甲醇诱导产xyn10酶菌株(G1、G4、G4-H)进行分析，G0菌株作为对照。对质谱数据进行统计分析，鉴定得到1 167个蛋白质，包括352个差异蛋白。随后对差异蛋白进行了GO分析和KEGG代谢途径分析，探究了蛋白表达的相关机制。研究还发现过量表达xyn10酶的调控基因HAC1会对菌株的生长造成一定的抑制，蛋白质组学分析可能是由于参与核糖体蛋白表达的蛋白表达降低而造成的。包括黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)在内的担子真菌具有分泌大量氧化水解酶及降解木质纤维素类生物质 (lignocellulosic biomass)的生物特性，对研究木质纤维素生物质能具有重要价值。Arulmani等［23］应用iTRAQ结合LC-MS/MS技术检测黄孢原毛平革菌分别在纤维素、木质素及纤维素与木质的混合物培养条件下分泌蛋白的差异。结果共有117个酶被鉴定。在纤维素和纤维素、木质素混合物培养条件下，内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶等显著上调且氧化、水解的纤维素被降解。当木质素为主要碳源时，铜自由基氧化酶、异戊氧化酶等表达并显著上调。小麦条锈病由专性寄生真菌小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起，在世界范围内广泛流行。小麦抗条锈病基因WKS1表现出对条锈病不同生理亚种的广谱抗性，能有效降低条锈病危害，减少产量损失。李坤等［24］利用iTRAQ技术，以WKS1基因近等基因系RSL65(含WKS1)和LDN(不含WKS1)为材料，研究不同材料间和接菌前后的差异表达蛋白，鉴定得到861种蛋白。与LDN接菌前样品相比，RSL65接菌前、RSL65接菌后、LDN接菌后的3种样品有58种蛋白均表现显著差异，其中26种蛋白表达上调，32种蛋白表达下调。差异表达蛋白多与细胞器构成、光合作用和转录激活相关，主要参与代谢过程、信号传递、防御和抗胁迫等生物过程。

3 小 结

比较蛋白质组学是当今蛋白质组学研究的重要领域，比较不同生理和病理状态下细胞内蛋白质的表达及修饰，对于揭示生理和病理过程具有重要意义。iTRAQ技术作为一种新的、功能强大的比较质白质组学技术，比较于2D-DIGE、ICAT等传统技术，具有高通量、重复性好、能够处理复杂样本等优点，其在真菌研究中的应用价值已得到初步验证，但对真菌与宿主相互作用过程中的蛋白质组学变化仍研究较少，因此对病原真菌与宿主相互作用的研究可能是真菌比较蛋白质组学新的研究方向之一。尽管iTRAQ技术仍存在一些缺点和不足，但随着蛋白质组学及生物信息学等技术的不断完善，iTRAQ技术将会成为真菌比较蛋白质组学研究的重要技术手段，从而为探究真菌致病机制、寻找新的抗真菌药物靶标等起到推动作用。

［1］ Ross PL，Huang YN，Marchese JN，et al.Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents［J］.Mol Cell Proteomics，2004，3(12):1154-1169.

［2］ Phanstiel D，Unwin R，Mcalister GC，et al.Peptide quantification using 8-plex isobaric tags and electron transfer dissociation tandem mass spectrometry［J］.Anal Chem，2009，81(4):1693-1698.

［3］ Pandey A，Mann M.Proteomics to study genes and genomes［J］.Nature，2000，405(6788):837-846.

［4］ Pierce A，Unwin RD，Evans CA，et al.Eight-channel iTRAQ enables comparison of the activity of six leukemogenic tyrosine kinases［J］.Mol Cell Proteomics，2008，7(5):853-863.

［5］ 王林纤，戴勇，涂植光.iTRAQ标记技术与差异蛋白质组学的生物标志物研究［J］.生命的化学，2010，30(1):135-140.

［6］ Schwacke JH，Hill EG，Krug EL，et al.iQuantitator:a tool for protein expression inference using iTRAQ［J］.BMCBioinformatics，2009，10:342，doi:10.1186/1471-2105-10-342.

［7］ Shadforth IP，Dunkley TP，Lilley KS，et al.i-Tracker:for quantitative proteomics using iTRAQ［J］.BMC Genomics，2005，6:145.

［8］ 谢秀枝，王欣，刘丽华，等.iTRAQ技术及其在蛋白质组学中的应用［J］.中国生物化学与分子生物学报，2011，27(7):616-621.

［9］ Gygi SP，Rist B，Gerber SA，et al.Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags［J］.Nat Biotechnol，1999，17(10):994-999.

［10］ Wu WW，Wang G，Baek SJ，et al.Comparative study of three proteomic quantitative methods，DIGE，cICAT，and iTRAQ，using 2D gel-or LC-MALDI TOF/TOF［J］.J Proteome Res，2006，5(3):651-658.

［11］ Wiese S，Reidegeld KA，Mayer HE，et al.Protein labeling by iTRAQ:a new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research［J］.Proteomics，2007，7(3):340-350.

［12］ Martyniuk CJ，Alvarez S，Denslow ND.DIGE and iTRAQ as biomarker discovery tools in aquatic toxicology［J］.Ecotoxicol Environ Saf，2012，76(2):3-10.

［13］ 汪晓军，温海.蛋白质组学在医学真菌研究中的应用进展［J］.中国真菌学杂志，2008，3(3):181-185.

［14］ Cagas SE，Jain MR，Li H，et al.Profiling the Aspergillus fumigatus proteome in response to caspofungin［J］.Antimicrob Agents Chemother，2011，55(1):146-54.

［15］ Adav SS，Li AA，Manavalan A，et al.Quantitative iTRAQ secretome analysis of Aspergillus niger reveals novel hydrolytic enzymes［J］.J Proteome Res，2010，9(8):3932-3940.

［16］ 贾红玲.新生隐球菌生物膜外分泌蛋白初步分析的研究［D］.上海:第二军医大学，2012，doi:10.7666/d.y2110925.

［17］ Zhang JJ，Zhang L，Qiu JK，et al.Isobaric tags for relative and absolute quantitation(iTRAQ)-based proteomic analysis of Cryptococcus humicola response to aluminum stress［J］.J Biosci Bioeng，2015，doi:10.1016/j.jbiosc.2015.02.007.［Epub ahead of print］

［18］ Taylor RD，Saparno A，Blackwell B，et al.Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions［J］.Proteomics，2008，8(11):2256-2265.

［19］ Munoz-Gomez A，Corredor M，Benitez-Paez A，et al.Development of quantitative proteomics using iTRAQ based on the immunological response of Galleria mellonella larvae challenged with Fusarium oxysporum microconidia［J］.PLoS One，2014，9(11):e112179.

［20］ Rossouw D，Van den Dool AH，Jacobson D，et al.Comparative transcriptomic and proteomic profiling of industrial wine yeast strains［J］.Appl Environ Microbiol，2010，76(12):3911-3923.

［21］ Shi JH，Feng HX，Lee J，et al.Comparative proteomics profile of lipid-cumulating oleaginous yeast:an iTRAQ-coupled 2-D LCMS/MSanalysis［J］.PLoSOne，2013，8(12):e85532.

［22］ Lin XQ，Liang Sl，Han SY，et al.Quantitative iTRAQLC-MS/MS proteomics reveals the cellular response to heterologous protein overexpression and the regulation of HAC1 in Pichia pastoris［J］.J Proteomics，2013，91:58-72.

［23］ Manavalan A.，Adav SS，Sze SK.iTRAQ-based quantitative secretome analysis of Phanerochaete chrysosporium［J］.J Proteomics，2011，75(2):642-654.

［24］ 李坤.小麦抗条锈基因WKS1相关的蛋白组学及重组基因创建［D］.山东农业大学，2012.