ripply1在斑马鱼早期胚胎背腹发育中的作用

孟亚平，刘春业，石德利*

（1.山东大学生命科学学院，济南 250100；2.清华大学生命科学学院，北京 100084）

研究报告

ripply1在斑马鱼早期胚胎背腹发育中的作用

孟亚平1，2，刘春业1，石德利1*

（1.山东大学生命科学学院，济南 250100；2.清华大学生命科学学院，北京 100084）

目的探究ripply1基因在斑马鱼早期背腹轴发生过程中的作用。方法利用斑马鱼整封原位杂交技术揭示ripply1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达模式，通过显微注射技术在胚胎1细胞期注射ripply1的mRNA来高表达Ripply1蛋白并在后期观察胚胎背腹标记基因的变化及胚胎形态变化。利用Tol2转基因技术构建ripply1启动子驱动的GFP转基因鱼。结果原位杂交结果显示ripply1基因在斑马鱼原肠早期胚盾期特异表达在胚盾处，即预定的背部。高表达ripply1后，在胚盾期背部标记基因表达范围扩大，腹部标记基因表达减弱，受精后24小时胚胎表现出严重的背部化表型：头部增大，腹部卵黄延伸减弱，尾部躯干及尾部区域减少，有的甚至形成了第二个体轴。得到的转基因鱼揭示ripply1母源表达，并且转录起始位点上游1200个碱基驱动的GFP能模拟内源基因的表达图式。结论ripply1可能参与斑马鱼胚胎早期背腹轴的发生。

斑马鱼；ripply1；早期胚胎发育；背腹发生

胚轴（embryonic axes）形成是多细胞生物躯体模式（body plan）建立的一个重要过程，主要包括前ˉ后轴（anterior-posterior axis）、背 ˉ腹轴（dorsalventral axis）和左ˉ右轴（left-right axis）。对两栖动物胚胎的研究发现背ˉ腹轴早在受精后即可观察到，如爪蛙胚胎皮层转动形成的灰色新月区在后期发育成背部。德国发育生物学家Hans Spemann和他的学生Hilde Mangold将原肠早期蝾螈胚胎的背部组织移植到另一种蝾螈胚胎的腹部，得到了形成双体轴的胚胎，次级体轴的脊索来自于供体胚胎，而神经管和体节多数来自于受体，这说明该背部组织能诱导周围受体胚胎的细胞形成神经管，首次提出了胚胎诱导的概念并称该背部组织为组织者（organizer）。

ripply家族蛋白在2005年被发现并揭示了其部分功能［1］，研究发现ripply1和ripply2特异表达于体节，其中Ripply1蛋白与转录辅抑制因子Groucho结合，能够终止分节基因的表达，维持体节的前后极性。之后对ripply1的研究都集中在其在体节时期对体节发生的作用，而其在早期胚胎模式发生的作用却研究甚少。但最近在爪蛙中的研究发现ripply家族蛋白能通过其WRPW区域结合多梳蛋白（Polycomb group proteins）起转录去抑制的作用，并且在背ˉ腹轴形成过程中起重要作用［2］。然而，ripply家族基因在胚胎发育早期的表达图式和调节方式还不清楚。并且，ripply3是人的唐氏综合征关键区域基因6（Down syndrome critical region gene 6，dscr6）的同源基因［3］。因此，研究ripply家族基因的功能和作用机制能为人类遗传疾病的致病机理提供信息。我们通过原位杂交技术发现ripply1在斑马鱼早期胚胎中特异表达在背部，因此推测其可能参与背腹发生。故而通过过表达ripply1，并调取1.2 kb的启动子片段，初步研究其在胚胎早期背腹发生的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

AB品系的斑马鱼养殖在28.5℃的循环水系统中，如早期工作所描述［4］。

1.2 方法

1.2.1 获取ripply1 cDNA

取斑马鱼胚盾（shield）时期的胚胎50枚，用Trizol方法提取胚胎总RNA，使用Transgene公司TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒反转录，详细步骤参见使用说明书。

1.2.2 斑马鱼ripply1整胚原位杂交

调取ripply1全长cDNA，引物序列如下ripply1-F：5’-CAGCGCCAAACAAAACG-3’，ripply1-R：5’-TCAAATTCGCACAGACGG-3’，使用Taq酶扩增后将其连入pGEM-T载体中。根据测序方向合成地高辛标记的反义RNA作为探针使用。其他探针如goosecoid（gsc）、chordin（chd）、floating head（flh）、even-skipped-like 1（eve1）、T-box6（tbx6）、wnt8a详见作者以前的工作［5］。

合成的ripply1反义RNA用原位杂交液hyb+（50%甲酰胺，5×SSC，0.1%Tween-20，0.5 mg/mL酵母RNA，0.05 mg/mL肝素）稀释至1 ng/μL。收集不同时期的斑马鱼胚胎，固定于4%多聚甲醛中过夜。过渡到含0.1%Tween-20的PBST中，并在PBST中将胚胎膜剥去，用PBST洗过后在原位杂交液hybˉ（50%甲酰胺，5×SSC，0.1%Tween-20）中65℃孵育10 min，之后在hyb+中65℃孵育4 h。探针60℃孵育过夜。第2天吸出探针以重复使用。胚胎用洗液I（50%甲酰胺，2×SSC，0.1%Tween-20）洗30 min（60℃），重复1次；用洗液II（5%甲酰胺，0.2×SSC，0.1%Tween-20）洗15 min（60℃），重复1次；用洗液 III（0.5%甲酰胺，0.02×SSC，0.1%Tween-20）洗30 min（60℃），重复1次。然后用MABT在室温下洗3次，用封闭液封闭4 h。偶联碱性磷酸酶的地高辛抗体1∶2500稀释于封闭液中，4℃孵育过夜。第3天吸出抗体以重复使用，用MABT在室温下洗30 min，重复1次；用PBST在室温下洗30 min，重复1次；在平衡缓冲液（0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl pH 9.5，0.05 mol/L MgCl2，0.1%Tween-20）中平衡10 min，加显色液（5 mL平衡缓冲液中加100μL 60 mg/mL左旋咪唑，100μL NBT/BCIP），室温避光，待信号足够强加多聚甲醛终止反应，在70%酒精中脱去浮色，拍照观察。

1.2.3 显微注射ripply1 mRNA

显微注射方法详见早期工作［5］。ripply1 mRNA注射剂量为每个胚胎200 pg。

1.2.4 ripply1启动子序列及转基因鱼的获得

从基因组中调取ripply1基因组上游约1.2 kb的片段，引物如下：promoter-F：5’-ATTCTCGAGGGATCCAAAACAGCTTAT-3’，promoter-R：5’-ATTAGATCTGAATGAATGAAGGCGCGT-3’。并且在上下游引物中分别引入Xho I和Bgl II酶切位点，双酶后切连入pT2A200R150G载体。

单独注射该质粒观察胚胎是否有荧光。有荧光后将该质粒和转座酶mRNA共注射，剂量均为50 pg，待该批注射的斑马鱼F0代性成熟后外交，筛选后代胚胎有特异荧光的F1代。

2 结果

2.1 整胚原位杂交揭示ripply1在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达模式

为了明确ripply1是否参与早期背ˉ腹轴的形成，我们首先利用整胚原位杂交检测该基因的时空表达图式。结果显示ripply1母源表达，但表达水平低。在原肠作用早期即胚环期表达增强且集中在预定背部的胚盾位置，在胚盾期ripply1在背部的表达继续增强，并且向侧部延伸。在原肠期，随着细胞运动的进行，ripply1主要表达在前脊索板中胚层和后部将要形成的体节中，但在脊索中胚层中没有表达（图1）。这个表达图式暗示ripply1基因可能在背ˉ腹轴和前ˉ后轴形成过程中起调节作用。

2.2 高表达ripply1导致胚胎背部化

我们下一步对ripply1在背ˉ腹轴形成中的作用进行了功能检测。在胚胎1细胞期通过注射ripply1 mRNA进行高表达，收集胚盾时期的胚胎进行原位杂交。分别检测背部标记基因gsc、chd、flh和腹部标记基因eve1、tbx6、wnt8a的表达。我们发现几乎所有ripply1注射的胚胎背部标记基因gsc、chd、flh表达不但在背部增强并且明显向腹侧扩增。相反，腹部标记基因eve1、tbx6、wnt8a表达明显减弱（图2）。这个结果说明高表达Ripply1改变了背腹细胞的命运，使背部区域扩大。显示ripply1能调节斑马鱼背部的发育。

注：（A-B）1细胞期胚胎侧面观和动物极观，显示ripply1的母源表达。（C-G）分别为相应时期的侧面观。动物极向上。（H-J）分别为相应时期的动物极观，胚胎背部向下，（K-M）分别为相应时期的背部观，胚胎前部向上。图1 整胚原位杂交显示ripply1在斑马鱼早期胚胎发育过程中表达图式Note.（A-B）1-cell stage lateral view and animal pole view，showing ripply1 maternal expression.（C-G）Lateral view of indicated stageswith animal pole on the top.（H-J）Animal pole view of indicated stageswith dorsal side on the bottom.（K-M）Dorsal view of indicated stageswith anterior region on the top.Fig.1 ripply1 maternal and zygotic expression patterns in early zebrafish developmental stages.

在10 hpf（胚芽期）时观察胚胎的表型，发现原本呈球形的胚胎前后伸长，呈现明显的椭球形，这是典型的背部化表型（图3A，B）。24 hpf后观察胚胎，大多数胚胎（82/99）表现出背部化，其中36枚胚胎头部增大，尾部缺失（图3C，D），而46枚胚胎头部明显增大，体轴变短，尾部变短，无腹部尾鳍（图3E），一小部分胚胎（6/99）甚至呈现双体轴（结果未显示）。这些表型进一步说明ripply1通过抑制胚胎后部发育来促进前部的发育。

注：（A，C，E，G，I，K）未注射ripply1 mRNA相应基因在胚盾期表达情况，动物极观，背部处在右边。（B，D，F，H，J，L）注射ripply1 mRNA后相应基因在胚盾期表达情况，动物极观，背部处在右边。数据显示该结果所占的比例。图2 高表达ripply1后背腹标记基因在胚盾期的变化Note.（A，C，E，G，I，K）The expression of indicated genes at shield stage in uninjected embryos.Animal pole view and dorsal is to the right.（B，D，F，H，J，L）The expression of indicated genes at shield stage in ripply1 mRNA-injected embryos.Animal pole view and dorsal is to the right.Fig.2 ripply1 overexpression causes the expression pattern changes of dorsal-ventralmarker genes.

注：（A，C）胚牙期（10 hpf）和24 hpf野生型胚胎。（B）注射ripply1 mRNA胚胎在尾芽期呈椭圆型。（D）严重表型。（E）较轻表型。图3 高表达ripply1后导致胚胎背部化和躯干及尾部缺失。Note.（A，C）Bud stage（10 hpf）and 24 hpfwild-type（WT）embryo.（B）Oval shape of ripply1 dorsalized embryo atbud stage.（D）Severe phenotype and（E）slightlymild phenotype.Fig.3 Dorsalized phenotype and trunk and posterior truncation of ripply1 injected embryos.

2.3 ripply1启动子及转基因斑马鱼

为了研究ripply1时空表达的调节机制，我们开展了对其启动子的研究。获得ripply1转录起始位点上游1.2kb的片段后，将其后加EGFP，然后克隆到pT2A200R150G转基因载体上（图4A，B）。质粒注射后发现在胚盾期在胚盾处有特异的荧光表达（图4C，D），体节期在体节处有特异的表达（结果未显示），说明该1.2 kb的片段能够调控ripply1在斑马鱼胚胎中时空特异的表达。与转座酶共注获得转基因鱼ripply1：EGFP的F0代，发现其子代在1细胞期即有荧光，直到胚盾期仍是泛表达（图5AC’），可能是由于EGFP比较稳定，而母源的ripply1比较容易降解。在体节期该荧光则特异定位在躯干（图5D，D’）。在24 hpf，EGFP信号主要集中在体节中（图5E），而在成鱼中，EGFP信号主要集中在整个躯干部分（图5F-G’）。

注：（A）ripply1转录起始位点上游1.2 kb序列。（B）ripply1：EGFP质粒图谱。（C，D）注射ripply1：EGFP质粒后荧光信号位于胚盾期胚胎的背部。动物极观（C）和侧面观（D）。图4 注射ripply1：EGFP质粒后在胚盾期荧光表达情况Note.（A）1.2 kb ripply1 promoter sequence upstream of the transcription start site.（B）ripply1：EGFP plasmid map.（C，D）Localization of fluorescence signal driven by the1.2 kb ripply1 promoter sequence on the dorsal side of the shield stage embryo.Animal pole view（C）and lateral view（D）.Fig.4 Localization of fluorescence on the dorsal side at shield stage following injection of ripply1：EGFP plasmid

注：（A，B）受精后10 min和1细胞期胚胎荧光信号。侧面观。（C，C’）胚盾期荧光信号。动物极观和侧面观。（D，D’）体节期胚胎荧光信号。D’是D的躯干部放大图。（E）24hpf荧光信号。（F，G）斑马鱼成鱼及躯干放大部分。（F’，G’）成鱼及躯干放大部分的荧光信号图5 ripply1启动子转基因F1代鱼的荧光表达图式Note.（A，B）Fluorescence at10 min after fertilization and 1 cell stage embryos.（C，C’）A shield stage embryo，animal pole view and lateral view，respectively.（D，D’）A somite stage embryo.D’is a highermagnification of the trunk region in D.（E）A 24 hpf embryowith fluorescence restricted in the somites.（F，G）An adult fish.G is a highermagnification of F at the trunk region.（F’，G’）Fluorescence pattern in F and G，respectively.Fig.5 Fluorescence signal in ripply1 promoter-driven GFP F1 progeny transgenic fish

3 讨论

近年来许多研究关注ripply1在体节发生中的作用，ripply家族基因包括ripply1、ripply2、ripply3，其与T-box蛋白存在相互作用，三者均可通过结合tbx24抑制其转录激活［6］。爪蟾中Ledgerline可明显抑制Tbx6的表达［7］，Bowline同样能够抑制tbx6对下游基因的激活作用［8］。对ripply基因家族的进化树分析表明ripply1基因只出现在后口动物中，非洲爪蟾中无ripply1，存在两个ripply2同源基因Ledgerline/ripply2.1和 Bowline/ripply2.2，可能会补偿ripply1的作用［9］。另有爪蛙研究表明XDSCR6/ Ripply3通过拮抗多梳家族蛋白（polycomb group proteins）参与胚胎背腹轴的形成［2］，该研究为我们研究斑马鱼中Ripply1参与胚胎背腹轴形成提供了一种可能的机制。

原位杂交结果表明ripply1特异定位在胚盾期的背部，可能参与背腹发生，高表达ripply1能增强背部基因的转录水平并抑制腹部基因的转录，导致胚胎背部化表型，因此，我们的实验结果说明ripply1在胚胎背腹轴形成方面有重要作用。这些结论与在爪蛙中研究XDSCR6/Ripply3所得到的结果一致［2］。

原位杂交揭示的是mRNA的表达模式，而启动子的研究则可以在一定程度上揭示基因在蛋白水平的表达模式，单独注射ripply1：EGFP质粒只能在胚盾期观察到特异荧光，而转基因鱼结果则证明其母源表达，说明卵母细胞中有蛋白可以调控ripply1的表达，而受精之后合子基因的表达决定了ripply1在胚盾期的特异定位。

因此我们推测ripply1可能参与胚胎背腹轴，并且是发生在合子基因开始表达之后，但母源表达可能会对该作用有一定的影响。我们仍然需要ripply1敲除后的结果，以证明其在背腹发生过程中是必要的，而且ripply1以何种方式参与，是否涉及Wnt、BMP信号通路或者也是通过表观遗传水平调节背腹基因的表达仍待进一步的研究。启动子序列的获得有助于我们获得ripply1上游调控蛋白，从而绘制出完整的基因调控图谱。

［1］ Kawamura A，Koshida S，Hijikata H，etal.Groucho-associated transcriptional repressor ripply1 is required for proper transition from the presomitic mesoderm to somites［J］.Dev Cell，2005，9（6）：735ˉ744.

［2］ Li HY，Grifone R，Saquet A，et al.The Xenopus homologue of Down syndrome critical region protein 6 drives dorsoanterior gene expression and embryonic axis formation by antagonising polycomb proteins［J］.Development，2013，140（24）：4903ˉ 4913.

［3］ Shibuya K，Kudoh J，Minoshima S，etal.Isolation of two novel genes，DSCR5 and DSCR6，from Down syndrome critical region on human chromosome 21q22.2［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，271（3）：693ˉ698.

［4］ Cao JM，Li SQ，Shao M，et al.The PDZ-containing unconventionalmyosin XVIIIA regulates embryonicmuscle integrity in zebrafish［J］.JGenet Genomics，2014，41（8）：417ˉ428.

［5］ Cao JM，Li SQ，Zhang HW，et al.High mobility group B proteins regulate mesoderm formation and dorsoventral patterning during zebrafish and Xenopus early development［J］.Mech Dev，2012，129（9ˉ12）：263ˉ274.

［6］ Kawamura A，Koshida S，Takada S.Activator-to-repressor conversion of T-box transcription factors by the Ripply family of Groucho/TLE-associated mediators［J］.Mol Cell Biol，2008，28（10）：3236ˉ3244.

［7］ Hitachi K，Danno H，Tazumi S，et al.The Xenopus Bowline/ Ripply family proteins negatively regulate the transcriptional activity of T-box transcription factors［J］.Int JDev Biol，2009，53：631ˉ639.

［8］ Kondow A，Hitachi K，Okabayashi K，et al.Bowlinemediates association of the transcriptional corepressor XGrg-4 with Tbx6 during somitogenesis in Xenopus［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，359（4）：959ˉ964.

［9］ Janesick A，Shiotsugu J，TaketaniM，etal.RIPPLY3 is a retinoic acid-inducible repressor required for setting the borders of the pre-placodal ectoderm［J］.Development，2012，139（6）：1213ˉ1224.

科技工作者科学道德规范（一）

【编者按】学术不端行为是指违反学术规范、学术道德的行为，国际上一般用来指捏造数据（fabrication）、窜改数据（falsification）和剽窃（plagiarism）三种行为。但是一稿多投、侵占学术成果、伪造学术履历等行为也可包括进去。学术不端行为在世界各国、各个历史时期都曾经发生过，但是像中国当前这样如此泛滥，严重到被称为学术腐败的地步，却是罕见的。这不仅表现在违反者众多、发生频繁，各个科研机构都时有发现，而且表现在涉及了从院士、教授、副教授、讲师到研究生、本科生的各个层面。由于目前中国缺乏学术规范、学术道德方面的教育，科技工作者在学习、研究过程中发生不端行为，经常是由于对学术规范、学术道德缺乏了解，认识不足造成的。因此，对科技工作者进行学术规范、学术道德教育，防患于未然，是遏制学术腐败、保证中国学术研究能够健康发展的一个重要措施。

早在2007年，中国科协就发布了科技工作者科学道德规范，本刊重温此规范，以期在我刊营造一种健康的学术研究氛围，由于版面限制，我刊陆续将规范全文刊出。

第一章总则

第一条为弘扬科学精神，加强科学道德和学风建设，提高科技工作者创新能力，促进科学技术的繁荣发展，中国科学技术协会根据国家有关法律法规制定《科技工作者科学道德规范》。

第二条本规范适用于中国科学技术协会所属全国学会、协会、研究会会员及其他科技工作者。

第三条科技工作者应坚持科学真理、尊重科学规律、崇尚严谨求实的学风，勇于探索创新，恪守职业道德，维护科学诚信。

第四条科技工作者应以发展科学技术事业，繁荣学术思想，推动经济社会进步，促进优秀科技人才成长，普及科学技术知识为使命。以国家富强，民族振兴，服务人民，构建和谐社会为己任。

（待续）

The role of ripply1 in zebrafish dorsal-ventral development

MENG Ya-ping1，2，LIU Chun-ye1，SHIDe-li1*
（1.School of Life Science，Shandong University，Jinan 250100，China 2.School of Life Science，Tsinghua University，Beijing 100084）

ObjectiveTo explore the role of ripply1 in zebrafish dorsal-ventral development.M ethodsUsing zebrafish whole-mount in situ hybridization to examine the ripply1 expression pattern in early embryo development.To analyse the expression pattern changes of dorsal-ventral marker genes at shield stage and the morphological changes at 24 hpf（hours post-fertilization）after overexpression of ripply1 by injecting syntheticmRNA at1-cell stage.Using Tol2 transposon technology to obtain a ripply1 promoter driven GFP transgenic fish and to identify promoter region that recapitulates endogenous ripply1 expression pattern.ResultsThe in situ hybridization results revealed that ripply1 specifically expresses in the future dorsal region at shield stage.Overexpression of ripply1 caused an enhanced expression of dorsalmarker genes and a reduction of ventralmarker genes.Embryos overexpressing ripply1 also showed severely dorsalized phenotype，with enlarged head，reduced ventral yolk extension，and shortened posterior trunk and tail regions，and the formation of a secondary trunk axis.Transgenic fish revealed thematernal expression of ripply1 and suggested thata1.2 kb promoter-driven GFP is able to recapitulate the endogenous gene expression pattern.Conclusionripply1 may participate in the early developmentof dorsal-ventral axis in zebrafish embryo.

Zebrafish；ripply1；Early embryo development；Dorsal-ventral axis

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0446-07

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.002

2015-07-29

国家自然基金项目资助（No：31271556，31471360，J1103515）。

孟亚平，女，博士研究生，研究方向：Wnt信号通路，胚胎诱导核体轴形成。

石德利，男，博士，研究方向：Wnt信号通路，胚胎诱导核体轴形成。Email：dshi@sdu.edu.cn