薏苡仁酯对胶原诱导性关节炎小鼠Th17细胞分化作用研究

郑红霞章伟明周红娟张 雯于健宁汪 卫

薏苡仁酯对胶原诱导性关节炎小鼠Th17细胞分化作用研究

郑红霞1章伟明2周红娟1张 雯1于健宁1汪 卫1

目的 研究薏苡仁酯对胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠体内Th17细胞及其细胞因子白细胞介素－17（IL－17A）的作用。方法 健康SPF级DBA/1 7～8周雄性小鼠20只，测定造模对照组（经生理盐水治疗后CIA小鼠）、薏苡仁酯组（经薏苡仁酯注射液治疗后CIA小鼠）小鼠脾脏Th17细胞及血清中IL－17变化。应用流式细胞术（FCM）分析小鼠脾脏中Th17细胞的比例，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中IL－17A含量。结果 经薏苡仁酯注射液治疗后，薏苡仁酯组CIA小鼠脾脏中Th17细胞比例较造模对照组显著降低（1.82%比4.99%，P＜0.05），小鼠血清中IL－17A的含量也明显低于造模对照组［（3.54±0.61）pg/mL比（8.31±0.25）pg/mL，P＜0.05］。结论 薏苡仁酯对CIA小鼠Th17细胞具有分化作用。

小鼠；胶原诱导性关节炎；薏苡仁酯；Th17细胞；白细胞介素－17

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节滑膜炎症为特征的慢性自身免疫性疾病。炎症反复发作可导致关节内软骨和骨的破坏，最终导致关节功能障碍，甚至致残。Th17细胞是近年发现的一种不同于Th1、Th2细胞的新型CD4+效应性T细胞亚群，主要分泌IL－17，IL－6、TNF等细胞因子，Th17细胞及其分泌的细胞因子与RA疾病的严重程度成一致性[1－2]。薏苡仁中的薏苡仁酯具有抗肿瘤、解热镇痛及免疫调节作用[3－5]。本研究观察薏苡仁酯作用于胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠，对小鼠体内Th17细胞及其细胞因子IL－17的作用。报道如下。

1 材料与方法

1.1 动 物 健康SPF级DBA/1 7～8周雄性小鼠20只，平均体质量（18±2）g。购自上海斯莱克实验动物有限责任公司［许可证号码：SCXK（沪）2012－0002］。

1.2 药 品 薏苡仁酯注射液（商品名：康莱特注射液，浙江康莱特药业有限公司生产，批号1401032－1），生理盐水（杭州民生药业有限公司生产，批号C1404031）。

1.3 试剂及仪器 卡介苗购自中国药品生物制品检定所，牛Ⅱ型胶原（CⅡ）购自Chondrex公司，不完全弗氏佐剂购自美国Sigma公司。PE标记抗小鼠CD4抗体，FITC标记抗小鼠IL－17A抗体及其相匹配的同型对照抗体、莫能霉素（monensin）、小鼠IL－17A的ELISA检测试剂盒均购自eBioscience公司。离子霉素（ionomycin）、乙酸肉豆蔻佛波醇（phorbolmyristic acetate，PMA）购自Sigma公司。RPMI－1640培养液、小牛血清购自Gibco公司。仪器：流式细胞仪购自美国BECKMAN COULTER公司，型号EPICS XL。酶标仪购自美国，型号PowerWaveXS。

2 方法

2.1 造 模 取等体积CⅡ与弗氏完全佐剂1：1混合，充分研磨至混合物完全乳化，以乳化物滴入水中不松散为度（冰浴中操作），取乳化后的CⅡ于小鼠尾根部皮内注射（0.1mL/只），并使乳化物吸收完全。模型小鼠制备初次免疫（第0天），每只小鼠尾根部、背部多点（4～5点）皮内注射0.1mL/只乳化后CⅡ。加强免疫（第21天），尾根部、背部多点皮内注射同等剂量的该乳剂作为激发。

2.2 分组及给药 将造模成功的20只小鼠随机分为模型对照组10只，薏苡仁酯组10只。从造模第22天开始给药，薏苡仁酯组分别予薏苡仁酯注射液25mL/kg每天腹腔内注射1次。模型对照组注射生理盐水25mL/kg，每天腹腔内注射1次。治疗3周后处死小鼠。

2.3 小鼠脾脏中CD4+IL－17细胞比例检测 采用流式细胞术（FCM）、酶联免疫吸附试验（ELISA）。将分离出脾细胞用RPMIl640培养液按l：1体积比稀释后，加入PMA、离子霉素和莫能霉素并充分混匀，于37℃、50mL/L CO2细胞培养箱中培养5h，用于Th17细胞的检测。FCM测定各组用药后Th17细胞：将培养细胞加入10μL PerCp－抗CD3 mAb和10μL PerCp－抗CD4 mAb，于4℃避光孵育30min后，加NH4C1溶血剂2mL，以1500r/min离心5min。弃上清，加入1mL Fixation/Permeabilization穿膜45min。用洗液洗涤后，加入10μL PE抗人IL－17A Mat，于4℃避光孵育30min对胞内细胞因子IL－17A进行染色，最后经洗液洗涤后，以300μL PBS重悬细胞。检测染色固定后的标本。以CD4+T细胞设门，读取CD4+IL－17+T细胞在CD3+CD4+T细胞中的比率。

2.4 血清IL－17含量测定 ELISA检测血清IL－17含量，使用IL－17A ELISA kit按照说明书进行操作，用酶标仪检测血清样本的吸光度，计算样本浓度值。

2.5 统计学方法 应用SPSS12.0软件进行统计分析，各组数据以均数±标准差（±s）表示，组间采用两样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 用药后各组小鼠Th17细胞比例 通过FCM检测两组CD4+IL－17+T细胞比例变化，以CD4+T细胞设门，观察到薏苡仁酯组小鼠脾脏中Th17细胞比例为1.82%，较造模对照组的4.99%显著降低，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图l。

3.2 用药后各组小鼠血清IL－17水平 采用ELISA法检测两组小鼠血清中IL－17A含量，薏苡仁酯组IL－17含量为（3.54±0.61）pg/mL，显著低于模型对照组的（8.31±0.25）pg/mL，两组比较差异有统计学意义（t=22.78，P＜0.05）。

图1 FCM测定用药后两组TH17细胞比例

4 讨论

薏苡仁酯是中药薏苡仁中提取的有效成分，李大鹏从1975年开始研究从薏苡仁中提取分离抗癌活性成分，发现薏苡仁中的薏苡仁甘油酯具有抗肿瘤作用，嗣后又研制成功静脉注射用的“康莱特注射液”（koglaitelnjedion，商品名“康莱特”，又称KLT），在我国已获批准作为抗肿瘤处方药并得到临床推广应用[3]。薏苡仁酯除抗肿瘤作用外，早期药理研究表明薏苡仁有解热镇痛及免疫调节作用[4－5]。

效应性CD4+T细胞活化后，根据其产生的细胞因子和生物学功能的不同，可分为不同的细胞亚群，传统上将其分为Th1、Th2两个细胞亚群。近来研究发现一类不同于Th1和Th2细胞的CD4+Th亚群，该亚群细胞主要产生IL－17，并且不产生Th1和Th2类细胞因子，被命名为Th17细胞亚群[1，6－7]。Th17细胞除分泌IL－17外，也能分泌IL－6、TNF－α等多种细胞因子，具有较强的促炎症作用，参与多种自身免疫病的发生和发展[8－9]。胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis，CIA）是当前研究RA较理想和最为常用的动物模型，它在临床症状和病理表现方面与RA极为相似。国内多项研究发现，用流式细胞术及ELISA检测CIA模型小鼠中Th17细胞比例，结果发现CIA模型小鼠的脾脏和引流淋巴结Th17细胞均明显增加，小鼠血清中IL－17水平显著升高，这些实验数据提示Th17在CIA发病过程中具有重要作用[10]。基于这些机制的研究，并且考虑到中药薏苡仁其性凉味甘淡，具健脾渗湿、除痹止泻、清热排毒之效，且无毒性的优点，我们将薏苡仁酯用于RA的动物模型的研究，期望为RA的药物治疗寻找一种有效低毒的药物。

本研究发现薏苡仁酯作用于CIA小鼠后可使CIA小鼠脾脏中Th17细胞及血清中IL－17的含量明显降低（P＜0.05），结果提示薏苡仁酯对CIA小鼠Th17细胞分化可能存在有免疫抑制作用。但薏苡仁酯对CIA小鼠的进一步免疫调节机制还需要更加深入的研究。

［1］Park H，Li Z，Yang XO，et al.A distinct Lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17［J］.Nat Immunol，2005，6（11）：1133－1141.

［2］ Kirkham BW，LassereMN，EdmondsJP，etal.Synovial membrane cytokine expression is predictive of joint damage progression in rheumatoid arthritis:a two－year prospective study（the DAMAGE study cohort）［J］.Arthritis Rheum，2006，54（4）：1122－1131.

［3］李大鹏.康莱特注射液药效学及临床研究进展［J］.中国新药与临床杂志，2007，26（10）：778－782.

［4］谭煌英，高福云，崔建，等.康莱特注射液对癌症痛行为和肿瘤生长的影响［J］.中国中医药信息杂志，2006，13（1）：39－41.

［5］朱雏芳，朱梦莉，陈艳，等.三中成药治疗癌痛的疗效观察［J］.中国中医药科技，2014，21（1）：84－85.

［6］Reber PM.Prolactin and immunomodulation［J］.Am J Med，1993，95（6）：637－643.

［7］Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR，et al.Interleukin 17－producing CD4+effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages［J］.Nat Immunol，2005，6（11）：1123－1132.

［8］Shen H，Goodall JC，Hill Gaston JS.Frequency and phenotype of peripheral blood Thl7 cells in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2009，60（6）：1647－1656.

［9］Yang J，Chu Y，Yang X，et al.Thl7 and natural Treg cell population dynamics in systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Rheum，2009，60（5）：1472－1483.

［1 0］史烨，马洁，苏兆亮，等.胶原诱导性关节炎小鼠Thl7细胞的检测及意义［J］.江苏大学学报（医学版），2010，20（4）：299－301.

（收稿：2014－08－18 修回：2014－09－22）

Effect of Coixenolide on Differentiation of T Helper Cell 17 in Mice with Arthritis Induced by Collagen

ZHANG Hongxia1,ZHANG Weiming2,ZHOU Hongjuan1,ZHANG Wen1,YU Jianning1,WANG Wei1.1 Department of Rheumatology,Zhejiang Province Hospital of the Integration of Traditional Chinese and Western Medicine, Hangzhou(310003),China;2 Chinese Herb Pharmacy,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310003),China

Objective To explore the effect of coixenolide on T helper cell 17（Th17）and its cytokine interleukin－17（IL－17A）in mice with collagen－induced arthritis（CIA）.Methods Twenty DBA/1 mice at age of 7－8 weeks were used to build CIA model,then they were randomly divided into model group and coixenolide－treated group,with 10 mice in each group.Mice in coixenolide－treated group was injected with 25 ml/kg coixenolide and mice in model group were given injection of equivalent normal saline.The proportion of Th17 cells in the spleen of mice and serum IL－17A were determined by flow cytometry and enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）, respectively.Results The proportion of Th17 in the spleen of mice in coixenolide－treated group was significantly lower than that in model group（1.82%vs 4.99%,P＜0.05）.The serum IL－17 A of mice in coixenolide－treated group was significantly lower than that in control group[（3.54±0.61）pg/mL vs（8.31±0.25）pg/mL，P＜0.05].Conclusion Coixenolide has inhibitory effect on differentiation of Thl7 cells in CIA mice.

mice；collagen induced arthritis coixenolide；Th17 cells；interleukin－17

浙江省中医药科技计划项目（No.2011ZB106）

1浙江省中西医结合医院风湿免疫科（杭州 310003）；2杭州市第一人民医院中药房（杭州 310003）

郑红霞，Tel：13588458857；E－mail：zhx7854@163.com