蛇床子素诱导人肺腺癌细胞进入G2/M阻滞并引起凋亡性死亡研究

吕金敏

蛇床子素诱导人肺腺癌细胞进入G2/M阻滞并引起凋亡性死亡研究

吕金敏

目的 探讨蛇床子素（osthole）对人肺癌细胞A549的杀伤作用及其机制。方法 将人肺癌细胞A549用不同浓度的蛇床子素治疗后，采用MTT法检测蛇床子素对A549细胞增殖的抑制作用；通过流式细胞术检测A549细胞内DNA的含量测定蛇床子素对A549细胞周期的影响、蛇床子素处理后A549细胞凋亡情况；Western blot检测蛇床子素处理后A549细胞周期相关蛋白p-Cdc2和Cyclin B1及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果 蛇床子素对A549细胞增殖的抑制效应呈剂量依赖性，50μM、100μM、150μM的蛇床子素组增殖抑制率分别为（25.4±3.2）%、（40.2±3.7）%、（63.7±4.5）%。蛇床子素对A549细胞的凋亡诱导效应也呈剂量依赖性，50μM、100μM、150μM的蛇床子素组凋亡率分别为（9.4±1.4）%、（17.3±2.5）%、（22.9±3.3）%。蛇床子素处理后A549细胞周期相关蛋白p-Cdc2、Cyclin B1及抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下降，Bax表达显著增高。结论 蛇床子素可诱导人肺腺癌细胞进入G2/M阻滞，并引起肿瘤细胞凋亡性死亡。

人肺腺癌细胞；A549；凋亡；细胞周期；蛇床子素

肺癌是危害人类健康的世界性难题，死亡率居恶性肿瘤首位，其中非小细胞性肺癌约占80%[1]，我国肺癌的5年存活率不足15%[2]。蛇床子素是从蛇床子中提取的活性物质，中医用于治疗湿疹、皮肤瘙痒、阴道毛滴虫感染、性功能障碍[3]。近年研究发现，蛇床子素还具有抗炎症、抗肝炎以及抗肿瘤作用[4-6]，对于多种肿瘤均具有良好抑制作用。然而其对肺癌的抑制作用却很少报道，且抗肿瘤作用的机制也不十分清楚。我们通过研究蛇床子素（osthole）对人肺癌细胞系A549的生物作用，发现蛇床子素可以诱导肺癌细胞死亡，将A549细胞阻滞于G2/M期并使之发生凋亡。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人肺腺癌A549细胞来自于ATCC，培养在RPMI-1640培养基中，含10%胎牛血清，培养环境为37℃恒温且通入5%的CO2。

1.2 实验试剂 RPIM-1640培养基购自于Gibco公司，胎牛血清FBS购于杭州四季青生物工程有限公司，蛇床子素（osthole）、二甲亚砜（DMSO）、噻唑蓝（MTT）、碘化丙啶（PI）购于美国Sigma公司。PI和AnnexinⅤ凋亡试剂盒购自美国 ebioscience。βactin、Bcl－2、Bax、Cyclin B1、p－Cdc2抗体购自美国Cell signal公司，PVDF膜购于美国Millipore公司。

1.3 MTT试验 将A549细胞按1×104/孔接种于96孔板，加入200μL含10%FBS的RPIM－1640培养，设置3个复孔，并分别加入0、50、100、150μM的osthole培养24h及48h，之后加5mg/mL MTT 20μL，继续培养4h。弃上清，往孔中加150μL的DMSO，震荡使紫色絮状物完全溶解，570nm波长下用酶标仪检测OD值，细胞生长的抑制率以以下公式计算：抑制率=（ODPBS－ODosthole）/ODPBS×100%。

1.4 细胞凋亡试验 在A549细胞中分别加入0、50、100、150μM的osthole培养48h，按照试剂说明书将PI和annexin－V加入细胞中孵育20min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，细胞早期凋亡率用annexin－V单阳性细胞占所有细胞比值表示，细胞凋亡性死亡率（晚期凋亡）用PI、annexin－V双阳性细胞占所有细胞比值表示。

1.5 细胞周期试验 在A549细胞中分别加入0、50、100、150μM的osthole培养48h，之后收集细胞用PBS洗2次，用70%乙醇在4℃固定过夜，之后用PBS清洗一次，加入（50μg/mL）RNA酶，100μg/mL PI在暗处染色30min，流式细胞术检测细胞周期，G2/M阻滞用G2期细胞所占比率表示[7]。

1.6 Western blot试验 在A549细胞中分别加入0、50、100、150μM的osthole培养48h，然后取细胞裂解后做Western blot检测Cyclin B1，p－Cdc2，Bcl－2和Bax的表达，目标蛋白表达量由它们在胶片上显色后的灰度与相应β－actin的灰度比表示。

1.7 统计学方法 所有实验重复3次，实验数据用均值±标准差表示，并用SPSS11.0软件进行处理，P值计算采用非配对双边t检验以及单因素方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蛇床子素对人肺癌细胞系A549的抑制作用A549细胞在不同浓度osthole的作用下相比于PBS对照组均呈现出抑制效应，呈剂量依赖性,且用osthole处理48h较24h抑制作用显著增加，提示osthole对肿瘤细胞的杀伤作用有时间依赖性。表明蛇床子素具有体外抗肺肿瘤作用，见表1。

表1 不同浓度蛇床子素对A549肺癌细胞的抑制作用（±s）

表1 不同浓度蛇床子素对A549肺癌细胞的抑制作用（±s）

注：与0μM osthole组比较，*P＜0.01；与蛇床子素处理24h比较，△P＜0.01。osthole：蛇床子素

组别0μM osthole组50μM osthole组100μM osthole组150μM osthole组孔数3333浓度（μM）0 50 100 150 24h抑制率（%）0 25.4±3.2* 40.2±3.7* 63.7±4.5* 48h抑制率（%）0 36.7±3.0*△61.9±4.7*△83.4±5.9*△

2.2 蛇床子素诱导人肺癌细胞A549进入G2/M阻滞 为了研究蛇床子素是否能诱导A549细胞进入G2/M阻滞，我们用各种浓度osthole处理A549 48h并用流式细胞术检测细胞周期，我们发现随着osthole剂量的增加，进入G2/M阻滞的A549显著增加，见表2。有文献报导Cyclin B1和p－Cdc2是肿瘤细胞完成细胞周期的关键点，一些抗肿瘤药物通过下调Cyclin B1和p－Cdc2的表达使肿瘤细胞进入G2/ M阻滞，从而抑制肿瘤生长[8－9]。因此为了进一步在蛋白水平研究osthole对A549细胞周期的影响，我们用Western blot法检测肿瘤细胞周期相关蛋白Cyclin B1、p－Cdc2的表达，发现随着osthole剂量的增加，Cyclin B1和p－Cdc2的表达下降，见表2。

2.3 蛇床子素诱导人肺癌细胞A549凋亡 随着osthole剂量的增加，A549的早期凋亡率和凋亡性死亡率都显著增加，150μM osthole组对A549凋亡性死亡率相比于0μM osthole组约提升8倍，见表3。Bcl－2蛋白家族是细胞凋亡的关键调节蛋白，Bcl－2蛋白抑制凋亡，而Bax蛋白促进凋亡[10]。随着osthole剂量的增加，凋亡抑制蛋白Bcl－2表达下降而凋亡诱导蛋白Bax表达升高，见表3。

表2 不同浓度蛇床子素对A549细胞周期的阻滞效应（±s）

表2 不同浓度蛇床子素对A549细胞周期的阻滞效应（±s）

注：与0μM osthole组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。osthole：蛇床子素。

组别0μM osthole组50μM osthole组100μM osthole组150μM osthole组孔数3333浓度（μM）0 50 100 150 G2/M阻滞（%）4.0±0.5 9.6±0.8* 17.3±1.7** 25.4±2.9**灰度比（Cyclin B1/β－actin）0.38±0.08 0.29±0.06* 0.23±0.05** 0.17±0.03**灰度比（p－Cdc2/β－actin）0.30±0.07 0.23±0.05** 0.16±0.03** 0.09±0.01**

表3 不同浓度蛇床子素对A549细胞凋亡的诱导作用（±s）

表3 不同浓度蛇床子素对A549细胞凋亡的诱导作用（±s）

注：与0μM osthole组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。osthole：蛇床子素。

组别0μM osthole组50μM osthole组100μM osthole组150μM osthole组孔数3333 osthole浓度（μM）0 50 100 150早期凋亡（%）3.4±0.4 12.2±1.8** 15.5±2.1** 19.7±2.8**凋亡性死亡（%）2.8±0.2 9.4±1.4** 17.3±2.5** 22.9±3.3**灰度比（Bcl－2/β－actin）0.33±0.06 0.28±0.05* 0.19±0.04** 0.10±0.02**灰度比（Bax/β－actin）0.29±0.03 0.44±0.06** 0.63±0.11** 0.83±0.12**

3 讨论

诱导肿瘤细胞周期阻滞及引起肿瘤细胞凋亡是天然药物抗肿瘤活性的重要机制[11]。细胞周期阻滞能导致肿瘤细胞增殖的抑制并会诱导细胞凋亡[12]，其中G2/M期的阻滞是药物抗肿瘤机制的重要靶点，它能阻止DNA受损伤的细胞进入有丝分裂并使之停留于G2期来修复自身的DNA[13]。在本研究中我们发现蛇床子素通过下调Cyclin B1和p－Cdc2的表达影响肺癌细胞的周期。凋亡是细胞自身的一个重要的生理过程，它能帮助机体清除受损伤的细胞，肿瘤发生的过程往往就是细胞凋亡失控的过程。凋亡过程受细胞内多种因子的调节，其中的关键调节蛋白就是Bcl－2蛋白家族，本研究显示蛇床子素通过下调凋亡抑制蛋白Bcl－2的表达且增加凋亡诱导蛋白Bax表达，诱导人肺癌细胞A549发生凋亡性死亡。研究提示蛇床子素可能在人肺癌治疗中有广阔的应用前景。

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（收稿：2014－07－16 修回：2014－08－04）

Osthole Induces G2/M Arrest and Apoptotic Cell Death in Human Lung Cancer Cells

LV Jin Min.Clini－cal Laboratory,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China

Objective To explore the effects of Osthole on the proliferation of A549 cells treated with Osthole and the underlying mechanism.Methods A549 cells were treated with various concentrations of Osthole.Cell proliferation was measured by using the MTT assay.Cell cycle was evaluated by using DNA flow cytometry analysis. Induction of apoptosis was determined by flow cytometry.The expressions of cell cycle related proteins Cyclin B1, p-Cdc2 and apoptosis related proteins Bcl-2,Bax were evaluated by Western blotting.Results Osthole significantly inhibited the proliferation of A549 cells in a dose-dependent manner.The inhibitory rate of A549 cells treated with 50,100,and 150μmol/L osthole were（25.4±3.2）%,（40.2±3.7）%,and（63.7±4.5）%,respectively.Osthole also increased the apoptosis of A549 cells in a dose-dependent manner.The apoptosis rate of A549 cells treated with 50,100,and 150μmol/L osthole were（9.4±1.4）%,（17.3±2.5）%,and（22.9±3.3）%,respectively.Western blotting showed that Osthole down-regulated the expressions of Cyclin B1,p-Cdc2 and Bcl-2 and up-regulated the expression of Bax in A549 cells.Conclusion Osthole can induce apoptotic cell death and G2/M arrest of A549 cells.

human lung adenocarcinoma cell；A549；apoptosis；cell cycle；osthole

浙江中医药大学附属第二医院检验科（杭州 310005）