血浆miR-106b表达水平对乳腺癌的诊断价值

于 飞 吕金敏

血浆miR-106b表达水平对乳腺癌的诊断价值

于 飞 吕金敏

目的 探讨miR-106b对乳腺癌的诊断价值。方法 荧光定量PCR检测正常乳腺细胞系MCF-10A及乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435的miR-106b表达水平。收集30例乳腺癌患者临床病例资料，采集患者血浆，以健康人血浆作为对照，应用RT-PCR方法分析血浆miR-106b相对表达量与乳腺癌临床特征的关系，评估血浆miR-106b对乳腺癌的诊断效能。结果MCF-10A细胞miR-106b相对表达量为（1.00±0.08），MCF-7细胞为（5.15±0.45），MDA-MB-231细胞为（6.86±0.57），MDA-MB-435细胞为（3.86±0.29）。乳腺癌患者血浆及健康人血浆miR-106b相对表达量分别为（4.13±2.47）和（1.00±0.75）（P＜0.05）。乳腺癌患者血浆miR-106b相对表达量与患者年龄、肿瘤大小无相关性（P＞0.05），而与肿瘤分化程度、临床分期相关（P＜0.05）。经ROC曲线分析，miR-106b对乳腺癌患者和健康对照者诊断乳腺癌的AUC为0.831（95%CI：0.719～0.942），敏感性和特异性分别为86.67%和76.67%。结论 乳腺癌患者血浆miR-106b异常高表达可能成为乳腺癌诊断的新靶点。

乳腺癌；miR-106b；血浆；诊断

乳腺癌在女性群体中是发生率最高的恶性肿瘤，在过去的20年时间里，我国乳腺癌的发生率以每年3%～4%的速度增长[1]。早期诊断和治疗是提高乳腺癌治疗效果的关键因素，因此研究、发现更新更好的诊断方法对乳腺癌诊治有十分重大的意义。MicroRNA是近年来备受关注的一类细胞内源性的、非编码的小分子RNA，通过与其靶mRNA分子的3'端非编码区（3'-UTR）不完全互补配对，调节靶基因在转录后的蛋白表达水平[2]。研究发现血浆中一些特定的microRNA可指示肿瘤的发生[3]。本研究探讨血浆miR-106b对乳腺癌诊断的潜在临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2012年9月—2014年8月本院收治的乳腺癌患者30例，均未行化疗、放疗或其他肿瘤相关治疗，均为女性，年龄34～66岁，平均（46.2±12.5）岁，均经病理确诊。按2010年AJCC第7版TNM分期标准：I期10例，Ⅱ期13例，Ⅲ期7例。收集患者血浆检测miR-106b表达水平。另收集30名健康人血浆作为对照，均为女性，年龄31～68岁，平均（44.1±15.4）岁。所有实验步骤均取得患者知情同意。

1.2 细胞培养 人乳腺癌细胞株MCF-7、MDAMB-231、MDA-MB-435和人正常乳腺细胞系MCF-10A购于上海生科院细胞库。细胞培养在RPIM-1640培养基中，含10%胎牛血清，培养条件为37℃恒温，并通入5%CO2。

1.3 试剂和仪器 DMEM培养基、胎牛血浆购于美国Gibco。Trizol试剂、逆转录试剂盒购于美国Invitrogen。SYBR Green试剂购于日本TaKaRa。所有PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。Real Time PCR检测仪（ABI7500）为美国Applied Biosystems公司产品。

1.4 定量PCR检测miR-106b表达 取培养的细胞或500μL血浆，按试剂说明书，用500μL Trizol试剂提取总RNA。miR-106b逆转录采用特异性茎环引物法[4]，按试剂说明进行miR-106b的逆转录。miR-106b逆转录引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATTTCACG-3′。将该逆转录产物作为模板，用SYBR Green（TaKaRa，Japan）试剂盒进行定量PCR，miR-106b定量PCR上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGUUUGGCAAUGGUAGAA CU-3′，下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。将U6作为内参。△Ct1=CT（患者血浆/健康人血浆miR-106b表达）-Ct（患者血浆/健康人血浆U6表达），△Ct2=CT（健康人血浆miR182表达）-Ct（健康人血浆U6表达），△△Ct=△Ct1-平均△Ct2，miR-106b的相对表达以2-△△CT表示[5]。

2 结 果

2.1 乳腺细胞系miR-106b表达 定量PCR法检测人正常乳腺细胞系MCF-10A及3种乳腺癌细胞系miR-106b的相对表达，结果3种乳腺癌细胞系的miR-106b表达水平均显著高于正常乳腺细胞系（P＜0.05），见表1。

表1 乳腺癌细胞系和正常乳腺细胞系miR-106b相对表达水平比较（±s）

表1 乳腺癌细胞系和正常乳腺细胞系miR-106b相对表达水平比较（±s）

注：与MCF-10A细胞系比较，*P＜0.05

正常乳腺MCF-10A乳腺癌MCF-7乳腺癌MDA-MB-231乳腺癌MDA-MB-435 3333 1.00±0.08 5.15±0.45* 6.86±0.57* 3.86±0.29*

2.2 乳腺癌患者血浆miR-106b表达水平与临床病理特征的关系 乳腺癌患者血浆及健康血浆中miR-106b相对表达量分别为（4.13±2.47）和（1.00± 0.75），差异有统计学意义（P＜0.05）。而根据患者病理报告，乳腺癌患者miR-106b的异常表达与年龄和肿瘤大小无关（P＞0.05），与临床分期、分化程度相关（P＜0.05），见表2。

表2 乳腺癌患者临床指标与miR-106b相对表达量的关系（±s）

表2 乳腺癌患者临床指标与miR-106b相对表达量的关系（±s）

年龄（岁） ≤45＞45≤3＞3中、低分化高分化Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ期14 16 19 11 17 13 22 8 4.01±2.12 4.45±2.98 3.75±2.69 4.87±2.31 6.87±3.89 2.89±1.41 3.12±1.58 6.34±3.45 0.63肿瘤大小（cm）0.17分化程度0.005临床分期0.008

2.3 ROC曲线分析血浆miR-106b水平对乳腺癌筛查的价值 为了进一步研究血浆miR-106b水平在健康人和乳腺癌患者中的差异是否有临床价值，我们将患者/健康人血浆miR-106b Ct值与患者/健康人血浆U6 Ct值的差值（即△Ct）作为检测指标，用ROC曲线进行分析。结果miR-106b对乳腺癌患者和健康对照者诊断乳腺癌的AUC为0.831（95%CI：0.719～0.942），敏感性和特异性分别为86.67%和76.67%。见图1。

3 讨 论

图1 血浆m iR-106b水平对乳腺癌诊断的效能

microRNA是一组内源性的，非编码的，长度约为19～25个核苷酸的单链RNA，近年研究表明，microRNAs表达谱的改变和肿瘤的发生、发展、转移密切相关，癌变细胞能通过改变细胞microRNA表达谱促进致癌基因的表达和抑癌基因的沉默[6]。研究还发现microRNA可以作为一种新的肿瘤诊断标志物，检测患者血浆中特定microRNA的表达水平可有效提高恶性肿瘤的早期诊断率[6]。MiR-106b是一种致癌miRNA，研究发现miR-106b的高表达可促进胃癌细胞的生长，而且还能通过诱导TGF-α信号通路促进乳腺癌的转移[7-8]。这些研究表明了miR-106b具有促肿瘤生长的作用，且在肿瘤细胞中高表达。

本研究通过体外检测正常乳腺细胞系和乳腺肿瘤细胞系miR-106b表达水平，发现3种乳腺肿瘤细胞系的miR-106b表达水平相比于正常乳腺细胞系均显著增加，提示miR-106b可能在乳腺癌患者肿瘤细胞中高表达。乳腺癌患者血浆中miR-106b表达水平显著高于健康人，并且血浆miR-106b水平与乳腺癌患者肿瘤的临床分期和分化程度有关，分化程度越低，临床分期越高，则血浆miR-106b水平越高。这些结果说明肿瘤的恶性程度和转移程度越高，则入血的miR-106b越高，提示检测血浆miR-106b可能有助于乳腺癌的诊断和预后的判断。AUC-ROC曲线分析方法判断发现miR-106b曲线下面积为0.831，说明检测血浆miR-106b水平对于乳腺癌的诊断有较高的价值。

本研究结果提示miR-106b上调可能参与了乳腺癌的发生和发展过程，检测血浆miR-106b表达水平或可成为乳腺癌诊断、临床分级与预后评估的新方法。

［1］Guarneri V，Conte P.Metastatic breast cancer：therapeutic options according tomolecular subtypes and prior adjuvant therapy［J］.Oncologist，2009，14（7）：645-656.

［2］Bartel DP.MicroRNAs：genomics,biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116（2）：281-297.

［3］Hu A，Huang JJ，Sun GB，et al.miR-21 and miR-375 microRNAs as candidate diagnostic biomarkers in squamous cell carcinoma of the larynx:association with patient survival［J］.Am JTransl Res，2014，6（5）：604-613.

［4］Chen C，Ridzon DA，Lee DH，et al.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR［J］.Nucleic Acids Res，2005，33（20）：e179.

［5］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））Method［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［6］Zhao S，Yao DS，Ding N，et al.Aberrant expression of miR-20a and miR-203 in cervical cancer［J］.Asian Pac JCancer Prev，2013，14（4）：2289-2293.

［7］Kim YK，Yu J，Kim DH，et al.Functional links between clustered microRNAs：suppression of cell-cycle inhibitors by microRNA clusters in gastric cancer［J］.Nucleic Acids Res，2009，37（5）：1672-1681.

［8］Smith AL，Iwanaga R，Tan AC，etal.ThemiR-106b-25 cluster targets Smad7，activates TGF-beta signaling，and induces EMT and tumor initiating cell characteristics downstream of Six1 in human breast cancer［J］.Oncogene，2012，31（50）：5162-5171.

（收稿：2015-03-04 修回：2015-04-12）

Clinical Significance of Plasma M iR-106b Level in Breast Cancer Diagnosis

YU Fei,LV Jinmin. Clinical Laboratory,Second AffiliatedHospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China

Objective To investigate the diagnostic value of miR-106b in patients with breast cancer.M ethods The expression of miR-106b was detected by qPCR in normal breast cell line MCF-10A and breast cancer celllines MCF-7,MDA-MB-231,and MDA-MB-435.The clinical data of 30 patients with breast cancer were collected and blood samples from these patients were drawn to detect the expression level of miR-106b by RT-PCR. Plasma from healthy people served as control.The relationship of miR-106b relative level and clinical features was analyzed and the diagnostic efficiency of miR-106b was assessed.Results The relative expression levels of miR-106b incell lines were as follows:1.00±0.08 in MCF-10A, 5.15±0.45 in MCF-7,6.86±0.57 in MDA-MB-231, and 3.86±0.29 in MDA-MB-435.The relative expression ofmiR-106bwas 1.00±0.75 in healthy controls'plasma and 4.13±2.47 in patients'plasma（P＜0.05）.In breast cancer patients,the expression of miR-106b had no significantcorrelation with age and tumor size（P＞0.05）,but exhibited distinct difference among patients at different tumor differentiation levels and TNM stage（P＜0.05）.For discriminating breast cancer patients from normal people,the areaunder the receiver operating characteristic curve for plasma miR-106b was 0.831（95%CI:0.719-0.942）,andthe sensitivity and specificity were 86.67%and 76.67%,respectively.Conclusion The abnormal expression of miR-106b maybecome a new target in the diagnosis of breast cancer.

breast cancer;miR-106b;plasma;diagnosis

浙江中医药大学附属第二医院检验科（杭州310005）

于飞，Tel：15958015364；E-mail：xinhuayufei@163.com