MiR-26b增强顺铂对宫颈癌细胞株Hela的杀伤活性研究

董宇青 张瑞芳

MiR-26b增强顺铂对宫颈癌细胞株Hela的杀伤活性研究

董宇青 张瑞芳

目的 观察microRNA-26b（miR-26b）联合顺铂对宫颈癌细胞的杀伤效果，并探讨其作用机制。方法 荧光定量PCR方法检测人正常宫颈上皮细胞系CRL-2614及宫颈癌细胞系Hela、Si-Ha和C-33a的miR-26b表达水平。MTT法检测顺铂单独治疗及联合miR-26b治疗对宫颈癌细胞系Hela的杀伤活性。利用生物信息学及Western blot方法验证miR-26b是否调节Hela细胞Mcl-1表达。构建Mcl-1真核表达载体，MTT法检测Mcl-1表达载体转染对miR-26b联合顺铂杀伤Hela细胞疗效的影响。结果 宫颈癌细胞系miR-26b表达水平：Hela细胞为（0.21±0.04），SiHa细胞为（0.42±0.03），C-33a细胞为（0.33±0.03），显著低于正常宫颈上皮细胞系CRL-2614的（1.00±0.05）（P＜0.05）。miR-26b联合1μmol/L顺铂治疗组对Hela细胞的杀伤活性［细胞活力抑制率为（52.6± 6.9）%］显著高于1μmol/L顺铂单治疗组［细胞活力抑制率为（6.7±3.5）%］。miR-26b转染后，Hela细胞Mcl-1蛋白表达水平下降。miR-26b联合1μmol/L顺铂在Mcl-1表达载体转染后对Hela细胞的杀伤活性［细胞活力抑制率为（19.6±6.7）%］显著低于未转染Mcl-1表达载体的miR-26b联合1μmol/L顺铂组［细胞活力抑制率为（55.7±7.6）%］。结论 MiR-26b通过靶向于Mcl-1增强顺铂对宫颈癌细胞系Hela的杀伤活性。

宫颈癌；miR-26b；Mcl-1；Hela；顺铂

MicroRNA是一种内源性非编码单链RNA，能通过与靶基因mRNA的3’非编码区（3′UTR）配对结合下调靶基因的表达。最近研究发现microRNA的失调和肿瘤发生有关[1]。miR-26b（microRNA-26b）被报道与肿瘤发生、转移和耐药产生有关[2-3]，本研究探讨miR-26b是否在宫颈癌细胞中表达失调，并研究miR-26b是否能增强顺铂对宫颈癌细胞的杀伤活性。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人宫颈癌细胞系Hela细胞、SiHa细胞、C-33a细胞及人正常宫颈细胞系CRL-2614细胞购于美国ATCC（American Type Culture Collection）。宫颈癌细胞系和CRL-2614细胞均予含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，并加入0.1ng/mL人重组表皮生长因子，0.05mg/mL牛垂体提取物。所有细胞置于37°C恒温培养箱，通入5%CO2。

1.2 材 料 顺铂、噻唑蓝（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、二甲亚砜（DMSO）、表皮生长因子（EGF）、牛垂体提取物均购于美国Sigma-Aldrich。DMEM培养基、胎牛血清购于美国Gibco。细胞蛋白提取液购于江苏碧云天。兔抗人Mcl-1和兔抗人β-actin购于美国Cell Signaling。PVDF膜购于美国Millipore。ECL试剂盒购于美国Pierce。MiR-26b模拟物和阴性对照寡核苷酸（NCO）购于上海吉玛生物。miR-26b模拟物序列为：5'-UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3'；NCO序列为：5'-UGUAAUAAUGGAACUCGGAUU-3'。Trizol试剂、逆转录试剂盒、pcDNA3.1、Lipofectamine2000购于美国 Invitrogen。SYBR Green试剂购于日本TaKaRa。各PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 荧光定量PCR检测miR-26b表达 CRL-2614、Hela、SiHa和C-33a细胞总RNA用Trizol试剂提取。miR-26b的逆转录采用茎环RT-qPCR法（逆转录-定量PCR）[4]。将U6作为内参，miR-26b的相对表达由2-△△CT法计算[5]。miR-26b逆转录引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT TCAGTTGAGACCTATCC-3′。U6定量PCR上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4 质粒构建 将Mcl-1基因cDNA全长序列（Gene ID：NM_001197320）以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成pcDNA3.1-Mcl-1重组真核表达质粒[6]。

1.5 顺时转染 使用Lipofectamine2000按照试剂操作说明步骤将miR-26b或NCO（50pmol/mL），pcDNA3.1-Mcl（2μg/mL）转染入Hela细胞中，培养24h。

1.6 Western blot试验 将50pmol/mL miR-26b用Lipofectamine 2000试剂转染入Hela细胞中培养24h，收集细胞并裂解，裂解后的蛋白提取液用12.5%的丙烯酰胺进行SDS-PAGE，之后将凝胶取下，将蛋白转膜到PVDF膜上，并在Mcl-1或β-actin一抗稀释液中孵育过夜，之后在带辣根过氧化物酶活性的二抗稀释液中孵育2h，ECL试剂显色曝光。

1.7 MTT法检测药物对肿瘤细胞杀伤活性 将Hela细胞按5×103/孔接种在96孔板上。将50pmol/ mL miR-26b或阴性对照RNA（NCO）转染到细胞中，孵育24h，然后再加低浓度顺铂（1μmol/L）或高浓度顺铂（5μmol/L）培养48h。之后加5mg/mL MTT 20μL，继续培养4h。弃上清，570nmol/L波长下用酶标仪检测OD值，细胞活力抑制率计算公式：抑制率=（OD对照组-OD治疗组）/OD对照组×100%。

1.8 统计学方法 所有实验重复3次，实验数据用均值±标准差（±s） 表示，并用SPSS15.0统计软件进行处理，P值计算采用非配对双边t检验以及单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 宫颈癌细胞系下调miR-26b表达 三种宫颈癌细胞系Hela、SiHa和C-33a细胞的miR-26b表达水平均显著低于正常宫颈上皮细胞系CRL-2614细胞（P＜0.05），见表1。

表1 宫颈癌细胞系下调miR-26b表达（±s）

表1 宫颈癌细胞系下调miR-26b表达（±s）

注：与CRL-2614细胞比较，*P＜0.05

CRL-2614 Hela SiHa C-33a 3333 1.00±0.05 0.21±0.04* 0.42±0.03* 0.33±0.03*

2.2 各组Hela细胞杀伤活性比较 miR-26b联合顺铂治疗组对Hela细胞的杀伤活性显著高于同浓度顺铂单治疗组，见表2。提示miR-26b可显著增强顺铂对宫颈癌的治疗效果。

表2 各组Hela细胞活力抑制力比较（±s）

表2 各组Hela细胞活力抑制力比较（±s）

注：与NCO对照组比较，*P＜0.05；与miR-26b单治疗组比较，△P＜0.05；与1μmol/L顺铂单治疗组比较，#P＜0.05；与5μmol/L顺铂单治疗组比较，□P＜0.05；NCO：寡核苷酸

NCO对照组miR-26b单治疗组1μmol/L顺铂单治疗组5μmol/L顺铂单治疗组miR-26b+1μmol/L顺铂治疗组miR-26b+5μmol/L顺铂治疗组333333 0 50 005 0 50 001515 0 4.5±2.3 6.7±3.5 56.7±8.4* 52.6±6.9*△#85.4±9.9*△□

表3 pcDNA3.1-Mcl废除miR-26b对顺铂的协同作用（±s）

表3 pcDNA3.1-Mcl废除miR-26b对顺铂的协同作用（±s）

注：与NCO对照组比较，*P＜0.05;与miR-26b+1μmol/L顺铂治疗组比较，△P＜0.05；与miR-26b+5μmol/L顺铂治疗组比较，#P＜0.05；NCO：寡核苷酸

组别NCO对照组miR-26b+1μmol/L顺铂治疗组miR-26b+5μmol/L顺铂治疗组pcDNA3.1-Mcl-1+miR-26b+1μmol/L顺铂治疗组pcDNA3.1-Mcl-1+miR-26b+5μmol/L顺铂治疗组孔数pcDNA3.1-Mcl-1浓度（μg/mL）33333 00022 miR-26b浓度（pmol/mL）0 50 50 50 50顺铂浓度（μmol/L）01515细胞活力抑制率（%）0 55.7±7.6* 84.4±10.1* 19.6±6.7*△33.6±8.5*#

2.3 miR-26b增强顺铂对Hela细胞杀伤活性依赖于Mcl-1水平下调 生物信息学（http://www.targetscan.org/）结果表明，Mcl-1基因可能是miR-26b的靶点（图1），进一步实验结果表明，miR-26b转染Hela细胞后Mcl-1的表达量显著低于未转染miR-26b组（图2）。此外，MTT试验结果则发现pcDNA3.1-Mcl-1的共转染显著抑制了miR-26b联合顺铂对Hela细胞的杀伤活性，见表3。提示miR-26b增强顺铂对Hela细胞的杀伤活性可能通过下调Mcl-1的表达水平实现。

图1 Mcl-1基因是miR-26b的潜在靶点

图2 转染miR-26b下调Hela细胞Mcl-1表达水平

3 讨论

宫颈癌是全球发病率第二位的妇科肿瘤，每年有超过50万患者被诊断为宫颈癌，化疗是治疗宫颈癌的主要手段[7]。顺铂是目前最主要的抗肿瘤药物之一，能有效治疗结肠癌、卵巢癌、肺癌和宫颈癌[8-9]。长期化疗往往导致肿瘤耐药的发生，因此，如何选用最佳的辅助药物以取得最好的疗效，并降低顺铂的耐药性是目前肿瘤研究的热点[10]。

在本研究中，相比于正常宫颈上皮细胞系，宫颈癌肿瘤细胞系的miR-26b表达水平显著下调，表明miR-26b在宫颈癌细胞中可能发挥肿瘤抑制作用。有文献报道表明miR-26b在其他各种肿瘤类型中也同样发挥抗肿瘤作用，如miR-26b能通过下调CDK8的表达抑制乳腺癌细胞的增殖[11]，而在肝癌细胞中转染miR-26b则能显著抑制肿瘤细胞的增殖和转移凋亡[12]，这些报道和本研究均提示miR-26b可能是一个抑癌基因。然而，本研究发现miR-26b单独治疗宫颈癌的效果并不十分显著，却能显著增强顺铂对宫颈癌细胞的杀伤作用，通过进一步的研究发现，miR-26b的这种化疗协同作用可能和Mcl-1蛋白的下调有关。

Mcl-1是Bcl-2蛋白家族中一个重要的抗凋亡蛋白成员，它的高表达和肿瘤细胞的不良预后及多药耐药密切相关[13]。有报道[14]表明，肿瘤细胞中Mcl-1的高表达会显著增强包括宫颈癌在内的多种肿瘤的存活能力和对细胞毒性化疗药物的抵抗力。本研究结果显示，在Hela细胞中转染pcDNA3.1-Mcl-1重组质粒使细胞中Mcl-1发生过表达后，miR-26b对顺铂的协同抗宫颈癌作用受到显著抑制，证实miR-26b增强化疗药物抗肿瘤的机制是靶向于Mcl-1蛋白。综上所述，miR-26b/Mcl-1途径与顺铂的抗宫颈癌活性密切相关，它可能成为肿瘤化疗的一个新的靶点。

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（收稿：2015-03-26 修回：2015-04-13）

M iR-26b Enhances the Cytotoxicity of Cisplatin by Targeting M cl-1 in Cervical Cancer Cell Line Hela

Dong Yuqing,Zhang Ruifang. Clinical Laboratory,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou (310007),China

Objective To investigate the effect of microRNA-26b（miR-26b）on cisplatin therapy in treatment of cervical cancer in vitro,and to explore the underlying mechanism.M ethods The miR-26b level in normal cervical cell line CRL-2614 and cervical cancer cell lines Hela,SiHa and C-33a were detected by using RT-qPCR. MTT assay was performed to measure the growth inhibition capacity of miR-26b plus cisplatin in Hela cells. Bioinformatics and western blot were performed to determine whether the expression of Mcl-1 in Hela cells was regulated by miR-26b.A Mcl-1 expression vector was constructed to detect the role of Mcl-1 vector toward miR-26b plus cisplatin-inducing cytotoxicity in Hela cells by MTT assay.Results A down-regulation of miR-26b was found in cervical cancer cell lines Hela（0.21±0.04）,SiHa（0.42±0.03）,and C-33a（0.33±0.03）compared with that in normal cervical cell line CRL-2614（1.00±0.05）.The miR-26b plus 1mol/L cisplatin group showed a higher growth inhibition（52.6%±6.9%）than 1μmol/L cisplation group（6.7%±3.5%）in Hela cells.The expression of Mcl-1 at protein level was down-regulated after miR-26b transfection.The growth inhibition of Hela cells treated with miR-26b plus cisplatin was significantly decreased after transfection of Mcl-1 expression vector.Conclusion miR-26b sensitizes cisplatin-induced cytotoxicity by targeting Mcl-1 in cervical cancer.

cervical cancer;miR-26b;Mcl-1;Hela;cisplatin

杭州市中医院检验科（杭州 310007）

董宇青，Tel：15088687659；E-mail：hzdongyuqing@163.com