蔓荆子黄素对垂体瘤细胞GH3增殖抑制作用研究

应广宇 陈 高

蔓荆子黄素对垂体瘤细胞GH3增殖抑制作用研究

应广宇 陈 高

目的 观察蔓荆子黄素（vitexicarpin）对GH3垂体瘤细胞生长和增殖的影响，探讨其作用机制。方法 通过绘制含不同浓度梯度的Vitexicarpin培养基条件GH细胞生长曲线，观察Vitexicarpin对GH3细胞的作用；应用CCK-8试剂盒检测Vitexicarpin作用后的剂量时间效应，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率以及Western Blotting测定PARP、Caspase-3等凋亡相关蛋白表达。结果

垂体瘤；Vitexicarpin；GH3细胞系；凋亡

垂体瘤是起源于垂体前叶和垂体后叶及颅咽管上皮残余细胞的肿瘤，是最为常见的鞍区肿瘤，在颅内肿瘤中仅次于胶质细胞瘤和脑膜瘤，约占颅内肿瘤的9.6%[1]，由于肿瘤的占位效应和激素分泌异常导致一系列临床症状，严重影响患者的身心健康。目前临床上常用的治疗方法包括手术治疗、药物治疗、放射治疗等。手术作为垂体瘤的首选治疗方案，但是完全切除肿瘤的风险较高，同时术后可能出现严重并发症[2]。放射治疗也是常规治疗，用于缩小肿瘤体积，减少激素分泌。其缺点是会产生不可逆转的垂体功能减退[3]。随着多巴胺受体激动剂（如溴隐亭）以及生长抑素类似物的临床应用，垂体瘤药物治疗取得较为满意的疗效。但是，一项数据表明，目前仍然10%左右的患者存在不同程度的耐药问题[4]。因此，是否能找到一种治疗垂体瘤的新药物，成为研究人员新的方向。近期的多项研究表明，蔓荆子黄素（Vitexicarpin）对多种肿瘤细胞如乳腺癌细胞系MN1、人鳞状细胞癌细胞系A431、白血病细胞系K562[5-8]具有一定的抑制作用。本研究通过Vitexicarpin对垂体瘤细胞系GH3的体外研究，探讨Vitexicarpin对垂体瘤的治疗作用以及机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 Vitexicarpin购于杭州达文生物有限公司；GH3细胞系购于北京协和医学院细胞中心；CCK－8试剂盒（Cell Counting Kit－8）购于日本同仁化学研究所，Anti－PARP antibody（ab32138）、Anti－active +pro Caspase 3 antibody（ab47131）购于abcam公司；羊抗兔IgG－HRP、羊抗小鼠IgG－HRP购于美国Pierce公司。

1.2 细胞培养 GH3细胞系用F－10培养基，内含15%马血清+2.5%胎牛血清，100μg/mL青霉素以及100μg/mL链霉素，在37℃，5%CO2的条件下培养。对照组和药物作用组细胞均使用含血清的培养基处理。实验选择对数生长期的细胞进行。

1.3 细胞增殖抑制率测算 采用CCK－8法。取对数生长期细胞，将GH3细胞系以2×105/mL细胞浓度，接种于96孔板中，100μL/孔每个剂量平行设5个复孔，同时设空白对照。等贴壁细胞于24h后分别加入浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0μmol/L的 Vitexicarpin。对照组加入相同浓度的DMSO，分别在37℃，5%CO2培养箱中培养24、48、72h；每孔加入10μL的CCK－8试剂在37℃，5%CO2的条件下反应3h。用酶标仪测定在450nm处的OD值。按如下公式计算细胞活力：样品组平均OD值／空白对照组平均OD值×100%。相同实验重复3遍，计算平均值及标准差。由于GH3细胞系呈特定的半贴壁半悬浮生长，测定细胞活力时不宜吸取上清，故实验中选用CCK－8试剂盒测定细胞活力。

1.4 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。取指数生长期的GH3细胞以3×105/mL接种于6孔板内2mL/孔，设空白对照组和处理组置37℃，5%CO2培养箱中培养过夜。加入浓度10.0μmol/L的Vitexicarpin，对照组加入相同浓度DMSO，置37℃，5%CO2培养箱中培养。在二氧化碳培养箱继续培养0、24、48、72h后，用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化细胞，收集各孔悬浮在培养液中的细胞及贴壁细胞。预冷PBS洗2次，以1×binding buffer制成单细胞悬液，细胞浓度为0.5～1×106/mL。取100μL（约1×105个细胞）置流式管中，加PI和FITC标记的Annexin－V 5μL，混匀后室温下避光孵育15min。每管中再加入1×Binding Buffer 400μL，充分混合后流式细胞仪上检测细胞凋亡情况（尽快在1h内检测）。

1.5 PARP、Caspase－3测定 采用蛋白质印迹反应（Western Blotting）。取对数生长期细胞，将GH3细胞系以3×105/mL细胞浓度，接种于25cm2培养瓶中6mL/瓶；设空白对照组和处理组，处理组加入20.0μmol/L的Vitexicarpin，对照组加入相同浓度的DMSO，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。分别作用24、48、72h后离心收集药物处理后的GH3细胞，用冷的PBS清洗2遍。采用T－PER Tissue Protein Extraction Reagent（含Protease Inhibitor Cocktail）进行6个细胞总蛋白的提取，然后采用BCA定量试剂盒（碧云天生物科技有限公司）进行总蛋白定量。配制8%分离胶和5%浓缩胶，每个孔60μg总蛋白进行上样，每孔12μL，浓缩胶60V，分离胶80V进行电泳3h左右（PARP 4.5h左右）。PVDF膜甲醇中浸泡20s，然后转移到Tris－Glycine转移缓冲液（15%甲醇）（PARP转移缓冲液含5%甲醇）中平衡至少5min；SDS－PAGE胶在Tris－Glycine转移缓冲液平衡至少30min；在冷却条件下以100V恒压转膜2h。转膜结束后，放到TTBS（含5%脱脂奶粉）室温封闭1h，然后T－TBS漂洗，5min×3；一抗以1∶1000比例溶于T－TBS（含2%脱脂奶粉），4℃孵育过夜；然后T－TBS漂洗5min×4；内参β－actin以1∶1000溶于一抗稀释液中；二抗采用羊抗兔IgG－HRP以1∶8000溶于T－TBS（含2%脱脂奶粉），室温1h，然后T－TBS漂洗5min×5；内参βactin采用羊抗小鼠IgG－HRP以1∶10 000溶于二抗稀释液中；采用SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate，按说明书操作，制备约1mL ECL工作液，室温孵育转印膜1min，然后去除多余ECL试剂，保鲜膜密封，暗盒中放上X－film曝光5～10min后进行显影和定影。

1.6 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行统计分析，两组计量资料采用非独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Vitexicarpin对GH3细胞系增殖的影响 药物作用24h后观察细胞活力，当浓度达到2.5μmol/L时，可见到明显的细胞抑制现象；药物作用于细胞系48、72h后，当浓度达到1.5μmol/L即可观察到明显的细胞抑制现象；使用3.0μmol/L的Vitexicarpin作用GH3细胞系中，其24、48、72h的细胞活力分别在82.4%、57.8%、38.6%，提示Vitexicarpin对GH3细胞系的增殖具有抑制作用，且呈浓度及时间依赖性（见图1）。

2.2 Vitexicarpin对GH3细胞凋亡的影响 10μmol/ L的Vitexicarpin作用于3×105/mL细胞浓度，2mL/孔的6孔培养板中，分别作用0、24、48、72h后，流式细胞仪统计凋亡率[AV（+）PI（－）]为凋亡细胞。当出现AV（+）PI（-）时为细胞凋亡，当出现AV（+）PI（+）时为细胞死亡。结果显示，当一定浓度（10μmol/L）的Vitexicarpin作用于GH3细胞系，其24h凋亡率为（10.8±0.9）%，48h凋亡率为（16.8±0.6）%，而72h凋亡率为（29.8±1.6）%，虽然因为时间的增加死亡的细胞率也有所增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）。随着作用时间的延长，各时间点均有凋亡细胞增加，但是仅在作用72h后，细胞的凋亡率差异有统计学意义（P＜0.05）（见图2）。

图1 Vitexicarpin抑制GH3细胞系增殖

图2 Vitexicarpin对GH3细胞凋亡的影响

2.3 Vitexicarpin对caspase-3活性的影响 20μmol/ L Vitexicarpin处理24、48、72h的GH3细胞进行蛋白质印迹分析。结果显示，Vitexicarpin可以使32kD的Caspase-3剪切成17kD和12kD两个活性片段，PARP也由原来的116kD被剪切成85kD的片段。说明Vitexicarpin可能是通过激活Caspase-3活性，裂解PARP，从而启动凋亡程序（见图3）。

3 讨论

目前，多数研究认为蔓荆子主要通过下列两种途径发挥抗肿瘤活性：第一，蔓荆子中的某些细胞毒性成分发挥作用，抑制肿瘤细胞生长，干扰DNA合成，抑制细胞增殖诱导肿瘤细胞分化，从而诱导肿瘤细胞凋亡；第二，蔓荆子中活性成分可能通过阻止细胞分裂，形成周期阻滞[9-10]。

图3 Vitexicarpin对Procaspase-3、cleaved-caspase-3、PARP、cleaved-PARP蛋白的表达的影响1：24h对照组；2：24h处理组；3：48h对照组；4：48h处理组；5：72h对照组；6：72h处理组；

本研究应用CCK-8法检测Vitexicarpin对GH3细胞系在不同浓度不同时间的抑制活性，发现它对体外生长的垂体瘤细胞抑制作用存在明显的剂量和时间效应，进而进一步通过流式细胞术中凋亡细胞特有的AV（+）PI（-）特征，测定出在一定浓度的Vitexicarpin作用下GH3细胞呈现特有凋亡特征。因此，认为诱导凋亡为Vitexicarpin抑制GH3细胞增殖作用的一种重要机制。应用蛋白印迹的方法检测Vitexicarpin对GH3细胞系中相关蛋白表达的影响，结果发现Caspase-3和PARP均被剪切，从而进一步证实诱导细胞凋亡为Vitexicarpin对体外生长的垂体瘤细胞发生抑制作用的机制之一。

凋亡是发生在细胞中的一种受良好控制的程序性细胞死亡[11]，Caspase信号通路是细胞凋亡发生中重要的机制，通过活化下游的Caspase或者底物，启动并且传递链式反应[12]。Caspase-3是细胞凋亡中重要的功能蛋白酶，凋亡细胞内，32kD的原酶裂解为17kD和12kD的亚单位，两个亚单位组成二聚体，即活化的Caspase-3，活化的Caspase-3进一步水解活化其它Caspase酶及胞浆内目标（如D4-GDI）和核内目标（如PARP）[13]。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）是细胞凋亡的标志性核内底物，它参与DNA的修复及基因的整合，另外也能抑制与细胞凋亡晚期核小体间染色体的断裂有关的Ca2+/M92+依赖性核酸内切酶的活化。它的降解打破了细胞的平衡状态，细胞因此不能进行正常的生理活动，核酸内切酶的活化又促成了核内DNA的断裂，从而使细胞走向凋亡[11]。本研究通过Vitexicarpin作用的GH3细胞，发生Caspase-3和PARP均被剪切现象，Caspase-3的剪切表明经典凋亡的共同通道——天冬氨酸特异性半胱氨酸酶（caspase）级联反应启动了；而PARP的剪切表明，其级联反应的最终底物为PARP，通过级联反应，最终使细胞核内打破细胞的平衡，促使核内DNA的断裂，使细胞最终走向凋亡。

Vitexicarpin不仅能通过诱导细胞凋亡发生抗肿瘤作用，还能通过周期抑制、抑制有丝分裂活动机制产生作用[5]。本研究发现，在48h或者72h时间段，即使Vitexicarpin的作用浓度为5μmol/L，其对细胞的抑制率仍然能达到53.8%和66.6%，对比同时间段，高浓度的Vitexicarpin（10μmol/L）对细胞的凋亡率分别为16.8%和29.8%，这说明Vitexicarpin对GH3细胞的增殖抑制作用，不仅是通过诱导细胞凋亡，也可能通过多种机制发挥复合作用。Vitexicarpin对GH3细胞生长的抑制作用，除了促进凋亡，还存在哪些方面的机制，仍然是我们下一步研究的目标。

综上所述，线粒体途径诱导细胞凋亡是Vitexicarpin抑制垂体瘤体外细胞生长的机制之一。本研究结果表明它有可能成为新一种治疗垂体瘤的中药活性成分，具有较大的开发价值，但目前的研究还仅限于浅显的体外实验阶段，其在体内对细胞的影响还有待于进一步研究。

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（收稿：2014-10-24 修回：2014-10-28）

Inhibitory Effect of Vitexicarpin on Proliferation of Pituirary Adenoma GH3 Cells

YING Guangyu,CHEN Gao.Department of Neurosurgery,the Second Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou (310009),China

Objective To investigate the anti-proliferation effect of vitexicarpin on pituitary adenoma GH3 cells and explore the molecular mechanism.Methods The proliferation of GH3 cells treated with different solubility gradients of vitexicarpin was evaluated by drawing the cell viability curve.CCK-8 method was used to evaluate the time-and dose-dependent effects of vitexicarpin.The effect of vitexicarpin on GH3 cell apoptosis and the change of apoptotic protein PARP,Caspase 3 were determined by using flow cytometer and western blot,respectively.Results Vitexicarpin inhibited the growth and proliferation of GH3 cells in a time-and dose-dependent manner.Flow cytometry showed that vitexicarpin promoted GH3 cell apoptosis;western blot results found that caspase-3 was activated and PARP was degradated after vitexicarpin treatment.Conclusion Vitexicarpin can inhibit proliferation of pituitary adenoma GH3 cells partly via mitochondria-dependent apoptosis.

pituitary adenoma;Vitexicarpin;GH3 cells;apoptosis

浙江省中医药科技计划项目（No.2009CA065）

浙江大学医学院附属第二医院神经外科（杭州310009）

陈高，E-mail：yinggy1983@163.com；Tel：13777834056

Vitexicarpin可以抑制GH3细胞的生长和增殖，这种抑制作用有明显的剂量和时间效应，流式细胞检测结果显示其抑制增殖作用是通过诱导GH3细胞凋亡实现，Western Blotting检测发现Caspase-3活化，PARP裂解。结论 Vitexicarpin可以抑制GH3垂体腺瘤细胞增殖，其作用机制可能是通过线粒体介导的细胞凋亡通路。