核苷酸适体在靶向给药系统中的应用进展

·综述·

核苷酸适体在靶向给药系统中的应用进展

熊 叶1，台宗光1，2，李 强1（1.第二军医大学附属长海医院，上海 200433；2.解放军 92330部队医院，山东 青岛，266102）

适体，即体外合成筛选得到的能特异性地与靶分子结合的一段寡核苷酸序列。由于其独特的性质，在靶向给药系统中有着广阔的应用前景，目前已成为靶向给药研究领域的热点。综述了适体在靶向给药系统中的优势及其应用进展，并对其应用前景和面临的问题进行分析。

核苷酸适体；靶向给药；应用进展

核苷酸适体（nucleic acid aptamers）简称适体，是在体外合成并经过指数式富集法配体进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）筛选得到的一段DNA或RNA序列，该序列有独特的三维结构，能以极高的亲和力特异性地与靶分子或靶细胞结合［1］。适体技术在靶向给药系统中的应用已有10多年的历史，并在近几年越发受到国内外研究者的关注。适体与靶分子的结合与抗原-抗体结合作用相似，且适体具有明显优于抗体的许多特性，如靶分子范围广、与配体作用的亲和力高、特异性强、稳定性高、安全、经济、制备方法简单等优点。因此，适体在纳米靶向给药系统中的应用有着极大的优势与前景。

靶向给药系统是目前药物输送系统领域的研究热点。主动靶向给药是通过特异性的分子靶头介导，将药物输送到一类特定的细胞，选择性地作用于细胞，以提高药物治疗效果或减轻药物不良反应的一种治疗方法。适体主要应用于主动靶向给药系统，作为靶头协助实现药物的靶向治疗，在靶向给药领域展现了广阔的应用前景［2］。本文综述了近年来核苷酸适体在靶向给药系统研究领域中的应用进展，并对其应用前景和面临的问题进行了分析。

1 SELEX适体筛选技术介绍

最初的SELEX是在不同的实验室独立进行的。这种技术主要是基于迭代的体外扩增技术与酶联反应，应用了包括将近1015个分子的寡核苷酸库，以指数级富集每一轮筛选到的能与靶分子特异性结合的寡核苷酸配基（aptamer）［3］。SELEX的靶范围很广，几乎任何一种可以想到的蛋白质、肽类物质、小分子有机物，甚至复杂的混合物，都可筛到与之相匹配的寡核苷酸配基，而且特异性极强。目前应用最多的是2种SELEX方法。

1.1 传统的SELEX 传统的SELEX应用了包括将近1015个分子的寡核苷酸库，通过靶定结合位点、移除DNA、绑定序列的洗脱、放大和净化，最后测序候选适配子。传统的SELEX需要多道筛选（6～15次循环），虽然方法有效但是容易丢失个别具有强亲和力的适体，因为这些适体容易被高效扩增的弱亲和力适体掩盖。为了打破这种局限性，用高通量测序快速识别高亲和力的寡核苷酸适配子的方法及高通量适体筛选（HAPI screen）方法得以产生，这2种方法能够有效、特异性地筛选出高亲和力的适体［3］。

1.2基于细胞层面的SELEX 基于细胞层面的SELEX（cell-SELEX）是一种能产生与细胞特异性结合的DNA适体。例如，一种肿瘤细胞系能够用来作为靶点，产生能与之特异性结合的DNA适体。以能与培养出的特定靶细胞结合的单链DNA库作为筛选库的cell-SELEX已经开始被应用［3］。

2 适体在靶向给药系统中的优势

靶向给药系统的传统靶头主要是抗体、多肽、叶酸、透明质酸等与细胞表面某一靶点有亲和力的物质。但这些靶头物质在实际应用中存在难以克服的缺陷，例如单克隆抗体存在免疫原性、稳定性差、制备困难等问题，多肽、叶酸和透明质酸等小分子的靶点单一、亲和力低，这些都限制了靶向给药系统的临床应用和产业化进程。

与传统的抗体等靶头相比，适体保持着许多优势［4］。①适体易于合成和修饰，可以利用寡核苷酸合成技术体外合成，组成适体的核苷酸还可以根据需要进行硫代、卤代、甲基化等修饰，以提高其稳定性、亲和力和穿透力。②适体是一种小分子物质，与靶标结合力强且组织穿透力强，更有利于其穿透组织。③免疫原性和毒性较低，细胞生物相容性好。④适体的稳定性好，无论是以粉末或溶液形式存在，在体内、外均可保持较长时间的稳定。

近年来随着SELEX适体筛选技术的发展，也使得新适体的筛选变得更加容易。由于具备以上这些优势，适体可以说是靶向给药系统理想的靶头之一，特别是在癌症和某些感染性疾病的治疗方面。核酸适体作为抑制剂能抑制肿瘤生长过程中的相关靶蛋白，抑制肿瘤细胞增殖或促进凋亡。例如，首先进入临床研究的抑癌适体药物AS1411，它对肿瘤细胞的作用主要是调节核酶活性，损伤DNA，导致细胞凋亡。

3 适体介导的几种纳米靶向给药系统

与传统的给药方式相比，靶向给药系统可以将药物输送到特定的细胞或组织，因而受关注程度越来越高。适体介导的靶向给药系统在疾病治疗研究中有广泛的应用，特别是纳米材料和SELEX适体筛选技术的发展，使得适体介导的靶向治疗在理论上可以针对任何病变细胞。近10年来，研究者已将核苷酸适体应用于靶向给药系统的研究，修饰了DNA或RNA适体的给药系统可以实现对靶细胞的选择性给药，因而可在提高治疗效果的同时降低药物毒性。

3.1 前列腺特异性膜抗原适体介导的靶向给药系统 前列腺特异性膜抗原（PSMA）是一种跨膜蛋白，在前列腺癌组织中具有特异的高表达，而在前列腺以外组织中只有少量表达，可作为前列腺癌组织的标记，被认为是靶向给药中最有意义的靶标。Lupold等［5］于2002年首次筛选出以PSMA为靶标的A9和A10两种RNA适体，随后这两种适体在靶向给药方面有了许多应用。Farokhzad等［6，7］利用连接了A10适体的PEG-PLA纳米载体包裹荧光标记的右旋糖酐，与对照组相比，该给药系统能高效且有选择性地将药物递送到前列腺癌细胞系LNCaP细胞中，该小组随后将包裹药物换为多西他赛，通过裸鼠移植瘤模型对该给药系统进行评价，显示出较好的抗肿瘤效果，并明显降低了多西他赛的不良反应。

3.2 CD4适体介导的靶向给药系统 CD4是主要表达于辅助性T（Th）细胞的一种糖蛋白，是T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）识别抗原的共受体（co-receptor），CD4分子也是HIV病毒的受体，H IV病毒的攻击对象主要是CD4阳性细胞。靶向CD4蛋白的RNA适体由K raus等［8］于1998年发现，Guo等［9］利用噬菌体phi29RNA（pRNA，packing RNA）将CD4适体与siRNA结合在一起，通过CD4介导的内吞作用将siRNA导入到细胞内。Khaled等［10］认为噬菌体phi29RNA存在环状结构（R环或L环），siRNA和CD4适体可以进入噬菌体phi29RNA的环状结构，实现siRNA或CD4适体与噬菌体phi29RNA的结合，而phi29RNA又可形成二聚体或三聚体，以此实现siRNA与CD4适体的连接。研究证实形成的二聚体可进入CD4阳性的T淋巴细胞，沉默siRNA的目标基因。

3.3 表皮生长因子受体适体介导的靶向给药系统 表皮生长因子受体（EGFR）是细胞表面的一种配体蛋白，属于EGF受体家族的一员。研究表明，许多实体肿瘤中存在EGFR的异常表达，EGFR与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、凋亡及血管生成有关，并且EGFR还可以介导参与细胞的内吞过程［11］。Li等［12］于2010年利用体外纤维素过滤膜筛选法发现了以人EGFR为靶标的J18适体，并将J18适体以非共价结合的方式连接在黄金纳米粒的表面，随后的研究证实J18适体连接黄金纳米粒后，能够使细胞增加EGFR介导的内吞，同时减少非EGFR介导的内吞。

3.4 酪氨酸蛋白激酶7适体介导的靶向给药系统 酪氨酸蛋白激酶7（PTK 7）是蛋白酪氨酸激酶的一个亚型，在胚胎发育和上皮形成中扮演重要角色。某些急性髓系白血病（AM L）细胞中有PTK7的大量表达，并且PTK7的表达与AM L细胞的迁移和耐药有关［13］。Shangguan等［14］于2006年报道了一种对CCRF-CEM细胞（急性T淋巴细胞白血病细胞系）有亲和力的sgc8适体，后来研究发现sgc8适体的靶点为CCRF-CEM细胞表面高表达的PTK7，sgc8适体还可以通过受体介导的内吞作用进入到细胞内，因此sgc8适体可以作为配体用于针对急性T淋巴细胞白血病的靶向给药系统［15］。Huang等［16］把sgc8适体的5′端巯基化，通过巯基（-SH）与阿霉素相连形成适体-阿霉素复合物，该复合物不仅对细胞具有靶向亲和作用，而且在进入细胞后、在溶酶体的酸性环境下，巯基与阿霉素的连接可以断开，释放出游离的阿霉素发挥抗癌作用。Kang等［17］构建了PTK7适体-脂质体靶向给药系统，把sgc8适体通过PEG与右旋糖酐介导的脂质体相连接，每个脂质体上平均连接250个sgc8适体。因此对细胞有很强的靶向亲和力，研究证实该给药系统能够将模型药物高效递送到目标细胞中。

3.5 MUC1适体介导的靶向给药系统 MUC1蛋白是由muc1基因表达的高度糖基化（糖基化＞50%）、高分子量的跨膜蛋白，属于肿瘤表面的一类生物标志物，在一些上皮来源的癌细胞中特异性高表达［18］。研究还发现MUC1蛋白与细胞的内吞作用密切相关，MUC1蛋白可以介导细胞外物质内吞进入溶酶体并释放到细胞质中，因此特别适合作为适体的靶点［19，20］。Ferreira等［21］筛选出了一种以MUC1蛋白为靶点的适体，该适体与上皮来源的肿瘤细胞有很高的亲和力，药物二氢卟吩E6与该适体连接后，通过内吞作用进入细胞的药物量明显增加，超过单用二氢卟吩E6对照组的500倍，并且在缺少MUC1的O-肽聚糖（适体的结合位点）细胞上，没有发现二氢卟吩E6的药物毒性作用。这一研究表明，MUC1适体可以用于介导药物靶向上皮来源的肿瘤细胞。

3.7 NCL适体介导的靶向给药系统 核仁素（n ucleolin，NCL）又称C23，是真核细胞核仁中的一种蛋白质，参与核糖体的生物合成与成熟，以及胚胎发育、细胞增殖与生长、胞质分裂、染色体复制等过程。虽然几乎所有细胞中都含有NCL，NCL却只在部分肿瘤细胞表面有特异的高表达。AS1411适体的靶点是NCL，AS1411适体与NCL结合后的复合物通过内吞作用进入癌细胞，产生抑制癌细胞增殖的作用。因此AS1411适体有望成为肿瘤靶向给药系统的靶头，AS1411适体本身也是一个进入Ⅱ期临床试验的适体类抗肿瘤药物［24］。Cao等［25］对AS1411适体进行修饰，在3′端连接上胆固醇分子，通过胆固醇再与包裹顺铂的脂质体疏水表面相连，构建了适体-脂质体-顺铂靶向给药系统，研究证实该给药系统增加了癌细胞对顺铂的摄取，因此增强了顺铂对癌细胞的抑制作用。

4 适体的临床应用及其研究进展

哌加他尼钠（Macugen）仍是目前唯一已上市销售的适体药物，用于视网膜老年黄斑病变（AMD）的治疗。Ⅰ期临床结果表明，80%的患者在接受Macugen注射治疗3个月后，视力得到改善，病情稳定。Ⅱ期临床结果显示，60%接受M acugen和光动力疗法（PDT）联合治疗的患者，视力可提高3行以上，推测两者可能有协同作用。Macugen可用于所有类型AMD的治疗，而PDT仅对某一类型的AMD有效［26］。Macugen还可用于糖尿病性视网膜病变新生血管形成的治疗，患者用药后视力改善，视网膜厚度减小，仍需要进行光凝治疗的比例明显下降［27］。

目前，大量适体药物仍处于临床和临床前研究阶段，主要用于肿瘤、中枢神经系统、心血管系统疾病的治疗。抗肿瘤适体的研究主要集中在VEGF、血管生成素（Ang）、前列腺专属膜抗原（PSMA）、核仁素、细胞黏合素C（tenascin-C）、酪氨酸激酶受体（RET）、人表皮生长因子受体-3（HER-3）、MUC1等肿瘤标志性靶分子。中枢神经系统方面，Proske等［28］筛选得到特异性结合朊病毒蛋白（PrPSc）的ssDNA适体，体内应用后可有效抑制PrPSc的产生，因而可用于朊病毒病的预防与治疗。Jeon等［29］筛选出与流感病毒A血凝素分子的受体结合区域特异性结合的DNA适体，能够抑制病毒的血凝素活力，阻止病毒的感染。适体药物REG-1可特异性地与凝血因子Ⅸa结合，抑制凝血的发生［30］。

5 面临的问题和展望

适体介导的靶向给药系统为疾病的治疗提供了新的策略，但目前这一技术尚未成熟，缺乏有适体介导的靶向给药系统上市，其在实际应用中仍面临许多问题。①许多疾病细胞的靶点不精确，例如癌细胞的种类、恶性程度和位置不同，都会影响细胞表面标志物的类型和表达水平，这种不确定性可能会影响适体靶向作用的充分发挥。②通过SELEX技术筛选出的适体种类有限，目前只能开展针对部分疾病中的少数靶点进行靶向给药研究，因此需要筛选更多的适体，以满足多种疾病的靶向给药需求。③适体一般是通过体外化学合成得到，而体外核酸合成技术只适用于合成少量的寡核苷酸，生产成本较高，而核酸的大规模、高质量体外化学合成和纯化还比较困难。④适体以及适体介导的靶向给药系统其体内安全性还有待进一步评价，缺乏大规模临床研究资料支持。

在SELEX筛选技术发展成熟后，适体高通量、多靶点筛选的自动化程度已大为提高，新的各类适体不断涌现，适体应用于靶向给药系统的研究也日益增多，已成为药物研究的热点领域之一。适体介导的靶向给药系统已在动物模型中显示出较大优势，下一步是要实现适体介导的靶向给药系统在临床中的应用。相信随着研究的深入，该系统将在药物治疗领域有更加广泛的应用。

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Application p rogress of nucleic acid aptamers in targeted drug delivery system

XIONG Ye1，TAIZongGuang1，2，Li Qiang1（1.Changhai Hospital Affiliated to Second M ilitary Medical University，Shanghai 200433，China；2.Hospital of CPLA No.92330Troop，Qingdao 266102，China）

Aptamers are single stranded oligonucleotides that have high affinity and specificity towards a wide range of targetmolecules.Ow ing to the indispensable advantages，aptamers havew ildly prospects and have become a research hotspot in targeted drug delivery system（TDDS）.In this article，application advantage and progress of aptamers in TDDS were briefly reviewed，the problems and prospects were also discussed.

nucleic acid aptamers；targeted drug delivery；application progress

R943

A

1006-0111（2015）06-0490-05

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.06.003

2013-11-04

2014-12-24［本文编辑］李睿旻

国家自然科学基金项目（No.81170060）

熊 叶，硕士研究生，住院医师.E-mail：xiongye0104＠163.com

李 强，教授，主任医师.研究方向：支气管哮喘、慢性阻塞性肺病及肺部肿瘤的基础及临床研究.E-mail：liqressh＠hotmail.com