组蛋白去乙酰化酶抑制剂对重度失血性休克大鼠生存情况的影响

邓高荣，吴炳华，高翔，董玉莹，缪锌，黄巍，凌强，李宗芳

(1南昌大学第四附属医院，南昌330003;2西安交通大学第二附属医院)

失血性休克是由各种致伤因素创伤后急性失血引起，严重危及患者生命健康，是外科急救领域亟需解决的问题。除了传统的液体复苏外，研究结果表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)可抑制组织细胞程序性及非程序性死亡，故能减轻休克引起的重要器官功能损伤［1，2］，并显著改善失血性动物生存状况［3］，但国内未见相关研究报道。我们于2012～2013年选取软木酰苯胺氧肟酸(SAHA)和丙戊酸(VPA)两个常用HDACIs治疗重度失血性休克大鼠，观察其对大鼠生存时间与12 h内生存率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF清洁级健康成年SD雄性大鼠63只，体质量317～405 g，由南昌大学动物实验科学部提供。置于安静、恒温(20℃)、避光环境下适应性饲养3 d。微量注射泵(贝朗医疗，德国)、显微外科器械(江苏视卓医疗器械有限公司)、泰盟BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟软件有限公司)、NOVA血气分析仪(NOVA，美国)，血清乳酸试剂盒(南京建成生物)、戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司)、UV2450紫外可见光分光光度计(岛津，日本)和PE50导管(上海必鼎它生物)等。药物配制:使用前先将SAHA(Selleck，USA)溶解于DMSO做成母液，再将母液溶解于生理盐水中配置成浓度为5 mg/mL的溶液;VPA(Sigma-Aldrich，美国)溶解于生理盐水中配置成浓度30 mg/mL的溶液，经孔径0.22 μm针式过滤器过滤除菌。

1.2 动物分组及模型制备 所有大鼠实验前6 h禁食，可正常饮水、自由活动;动物称质量后用2%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉。右侧腹股沟及背部剪毛备皮、碘伏消毒，将PE50导管从背部皮下引至侧腹股沟皮下。腹部斜行切口内显微技术分离股动静脉，分别将PE50导管置入并固定于股动静脉中，检测导管通畅取2%肝素封管。将大鼠放置试验台等待麻醉清醒。采用股动静脉导管分时放血法建立总失血量占总血量60%的重度休克大鼠模型。大鼠总血量计算公式［2］为:总血量(mL)=0.06×体质量(g)+0.77。采用三段分时失血建模:第1个10 min内快速动脉失血达总失血量的50%，第2个10 min动脉失血达总失血的30%，第3个10 min内静脉失血达总失血量的20%，最后控制模型平均动脉压(MAP)为(45±5)mmHg者有效。成功建模48只，按照随机原则将模型大鼠分成三组，即SAHA组、VPA组和对照组各16只。

1.3 动物处理 建模成功后，按照大鼠体质量计算SAHA(8 mg/kg)和VPA(30 mg/kg)剂量再稀释成1 mL，经微量泵静脉10 min泵入;VPA 1 mL腹部皮下注射;对照组等量生理盐水静脉推注。

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动物建模的研究中发现，大鼠处于休克状态后血压具有很强的自我恢复调节能力，这种调节与休克程度密切相关。故在双阶段放血方式与梯度放血［4～6］的基础上，我们改进为三段分时失血建模，拟模仿外伤失血的过程，该法与实际情况更相符。我们认为失血速度约为3.2 mL/10 min为理想的失血速度。其中，还应该充分估计隐性失血，包括切口、皮下隧道及背部切口的失血。在股动静脉显露、分离及置管中尽可能采用显微外科技术，这样能够提高造模的成功率，本实验中造模成功率为76.19%(48/63)。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以±s表示，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

由于肿瘤等疾病的发生与表观遗传学关系密切，表观遗传修饰中组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)之间的动态平衡控制着染色质结构和基因表达，进而干扰疾病的发展进程。随着对HAT/HDACs研究的深入，失血性休克能诱导HAT/HDACs的比例不平衡，进一步影响细胞组蛋白或非组蛋白的乙酰化状态，HDACIs可以通过修正这种不平衡来改善组织器官的功能，故对各组织器官具有保护作用［7，8］。Zacharias等［9］还提出该机制涉及磷脂酰肌醇-3-羟基激酶及下游的蛋白激酶B，最后通过Bcl-2作为抗凋亡因子提高失血性休克动物的生存率。Gonzales等［10］使用 VPA和2-methyl-2-pentenoic acid(2M2P)治疗失血40%大鼠休克模型，12 h后与对照组相比，VPA治疗组70%和2M2P治疗组12%大鼠存活，而对照组无一存活。VPA治疗组12 h生存率远高于本实验的SAHA组(31.25%)和VPA组(12.50%)，主要因为本组模型为失血60%的重度休克。Hwabejire等［11］比较不同剂量VPA(300、400、450 mg/kg)治疗失血40%的大鼠休克模型，发现不同剂量VPA对大鼠生存影响不明显。Dekker等［12］采用 VPA+新鲜冰冻血浆(FFP)治疗猪失血性休克复合大脑损伤的模型，实验结果表明，其比单用FFP更明显提高大脑血小板活化水平，最终增强治疗效果。随着工业化社会发展，失血性休克发病率正在逐年上升。因此，寻求在传统液体复苏、输血及对症处理之外的抗休克治疗显得尤其重要，HDACIs对失血性休克器官保护作用研究符合这一创新观念［13］。

表1 三组体质量、建模前MAP、手术时间、总失血量及血乳酸水平比较(±s)

表1 三组体质量、建模前MAP、手术时间、总失血量及血乳酸水平比较(±s)

组别 n 体质量(g) 建模前MAP(mmHg) 手术时间(min) 总失血量(mL) 血乳酸(mmol/L)对照组 16 356.6±20.05 113.63±3.44 22.7±1.17 13.3±0.72 7.06±0.83 SAHA组 16 355.8±21.15 112.26±3.46 22.7±1.01 13.3±0.77 7.46±0.88 VPA组 16 349.4±19.61 112.36±3.39 23.4±3.11 13.0±0.71 7.53±0.74

综上所述，在当今的新媒体时代，对于报刊行业而言，提高报社记者新闻采编能力是尤为重要的，也是刻不容缓的。只有不断的提升报刊记者的新闻采编能力，才能够有效的提升报刊新闻的质量，以此来逐步的提升报刊行业在当前新闻传播领域的竞争力度，使其能够可持续性的发展下去。

2.2 各组生存时间和12 h内生存率比较 对照组生存时间(7.04±0.97)h、12 h内生存率0，SAHA组分别为(11.86 ±2.35)、31.25%(5/16)，VPA 组分别为(10.56±1.56)h、12.50%(2/16)。SAHA组、VPA组生存时间、12 h内生存率均高于对照组(P均＜0.05)，且SAHA组生存时间、12 h内生存率高于VPA组(P均＜0.05)。

3 讨论

1.4 观察指标及方法 血乳酸测定按血清乳酸试剂盒操作;股动脉采血检测血气分析(RAPIDLab348血气分析系统，德国)，采大鼠股动脉血0.5 mL滴入检测试剂片中，收集其pH、PaO2、PaCO2等生理指标对模型进行验证。经验证建模成功后按上述剂量与方式将相应药物注射后彻底堵管，注射青霉素抗感染。大鼠放置保温环境下自由活动，禁食禁水，待昏迷后用BL-420F生物机能实验系统连接大鼠肢体导联的心电监护。此外，建模过程中还应该注意无菌操作，大鼠正确的保温、固定及抗感染等。

2.1 各组体质量、建模前MAP、手术时间、总失血量及血乳酸水平比较 本实验重度失血性休克大鼠建模成功率为76.19%(48/63)。各组间体质量、建模前MAP、手术时间、总失血量及血乳酸水平比较差异均无统计学意义(P均＞0.05)。见表1。

本研究中，SAHA组休克大鼠生存时间、24 h生存率明显优于VPA组，表明HDACIs能够明显延长重度失血性休克大鼠的生存时间，而且SAHA对失血性大鼠的生存保护作用优于VPA。本研究与其他研究结果说明，失血性休克通过诱导 HAT/HDACs的比例失衡，进而影响细胞组蛋白或非组蛋白的乙酰化状态。我们推断，组蛋白乙酰化状态将与休克转归和次发的主要器官修复存在关联。HDACIs抗休克作用机制主要通过组织器官细胞凋亡实现的，HDACIs能导致Bcl-2在组织中高表达是最为有力的证据［9］，今后继续进行其他凋亡相关基因表达的实验观察和讨论;另一方面，组蛋白乙酰化状态也决定了染色质分子核小体空间状态的变化，其C-端疏水氨基酸位于核小体的内部，N-端的赖氨酸残基延伸出核小体外;组蛋白乙酰化酶乙酰化还能促进或防止与其他转录或调节相关蛋白的相互作用;组蛋白乙酰转移酶复合物参与转录激活、基因沉默、细胞周期调控、DNA复制、修复以及染色体组装等许多重要的生理过程［14］。因此，HDACIs有助于染色质分子呈舒展张开状态，能够加快休克修复应急蛋白的翻译合成，实现快速休克修复，这些机制皆值得进一步研究。

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1)顶板锚索规格为直径22 mm的1×19股高强度低松弛钢绞线，破断载荷580 kN，延伸率不低于7%，长度5.3 m，间排距为1 100 mm×1 000 mm；构件为高强度拱形托板，规格300 mm×300 mm×16 mm，初始张拉力不低于300 kN。

总之，两种HDACIs均能明显延长重度失血性休克大鼠的生存时间，提高12 h生存率;而且SAHA对失血性大鼠的生存保护作用优于VPA。

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