依赖解旋酶DNA等温扩增技术的研究进展

贾辉　胡兰　马晓威

摘 要：依赖解旋酶DNA等温扩增技术（HDA）是近年来发明的一种新型的模拟动物体内DNA复制的等温扩增技术，HDA具有简便、高效、快速的优点，不需复杂的科学仪器，反应在常温下进行，适用于基层实验室，具有广阔的应用前景。

关键词：依赖解旋酶DNA等温扩增技术；DNA解旋酶；单链DNA结合蛋白

依赖解旋酶DNA等温扩增技术（HDA），是美国NEB公司在2004年发明的核酸等温扩增技术。依赖解旋酶DNA等温扩增技术是模拟动物体内DNA复制的过程，不需要在昂贵的PCR仪上进行反应，仅在恒温水浴锅上使用即可完成反应。

1 HDA 的原理

HDA的原理极其简单，首先用解旋酶解开双链DNA，然后依靠单链DNA结合蛋白（SSB）与模板单链相结合，使模板单链始终处于单链状态，同时保护它的完整性，然后模板与引物进行杂交，在DNA聚合酶的催化下进行扩增，新合成的双链DNA作为模板继续扩增。

2 HDA检测方法的建立要点

2.1 模板的选择

一般情况下，解旋酶的解旋能力决定着可扩增序列长度。HDA选用的是大肠杆菌解旋酶Ⅱ（UvrD）解旋酶，UvrD的解链速度是20bp/秒，连续性是100bp，因此进行扩增的模板长度为70～120bp。

2.2 酶的选择

目前常用的解旋酶是大肠杆菌解旋酶Ⅱ（UvrD），UvrD在核酸的核苷酸的切除修复和错配修复中起到了重要的解旋作用，UvrD是由720个氨基酸组成的，是SF1解旋酶家族一员。还有一种新发现的解旋酶—T7噬菌体基因4编码蛋白，解链速度是300bp/秒，扩增质粒DNA的长度是2.5kb，它的解链速度比UvrD更快，扩增长度更长。目前常用的SSB包括T4噬菌体基因32编码蛋白和RB49噬菌体基因32编码蛋白；常用的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶或者是Klenow Fragment（3′-5′exo-）聚合酶。

2.3 引物设计

引物的最适长度是25～27bp，最大不超过33bp，Tm值在60～72℃，GC含量35%～44%。

3 HDA的反应体系及操作步骤

3.1 HDA的反应体系

HDA反应体系包括混合物A和混合物B，混合物A包括引物、模板、ddH2O、缓冲液；混合物B包括SSB、UvrD、三磷酸脱氧核糖核苷、DNA聚合酶、MutL和缓冲液。

3.2 HDA的操作程序

HDA的操作程序有两种做法：两步法和一步法。两步法：混合物A放在95℃水浴加热2分钟；然后在64℃水浴中3分钟退火；加入与混合物A等体积的混合物B，置于60～65℃水浴锅中反应75～90分钟，加入终止反应液结束反应。

一步法：操作过程比两步法更简单，省去两步法中的第一步，等体积混合混合A、混合物B，放在65℃的水浴锅中进行扩增。

4 HDA技术的优缺点

4.1 HDA的优点

和其他的等温基因扩增技术比较，HDA技术更加的简便、高效、快速，是一种正真做到在恒温下进行反应的扩增技术。HDA扩增的反应时间75～90分钟，整个反应在恒温下进行，只需要恒温水浴锅这一简单仪器，与其他基因扩增技术相比，适用于基层实验室对疾病的快速检测与诊断。HDA反应除去了5′～3′外切酶活性的BstDNA聚合酶，该操作不容易产生非特异性的扩增，增加反应的敏感性。

4.2 HDA的缺点

HDA是近几年新发明的一种等温基因扩增技术，研究者较少，且发展还不够成熟，目前还没有在基因扩增等方面的应用。

5 应用与展望

与其他技术相比，HDA技术简便、高效、快速，适用性广泛，在实时定量方法、凝胶电泳和ELISA实验中都可应用，同时适用于基层实验室对疾病的快速检测与诊断。已有研究通过对HDA体系的优化，成功建立了RT-tHDA检测方法。有研究表明，HDA能够扩增cDNA、微生物基因组DNA等基因片段，因其具有简便性、高效性、快速性等优点，该方法具有广阔的研究和发展前景。因为HDA的反应是完全在恒温下进行，特别适用于基层实验室，随着HDA这种等温扩增技术的快速发展，会有专门适于HDA操作的简单仪器出现。

HDA技术是模拟动物体内DNA的合成方式，具有高保真性和高敏感性。2006年New Englang Bio-labs在HDA的原有的基础上又发明了一种新的检测方法，即环HDA法，该方法不但可扩增大分子DNA片段，还可直接扩增完整的cDNA。该方法的发现为分子生物学再一次提供新的科研手段。该方法使基因的扩增和基因的筛选同时完成，分析和构建质粒DNA的时间逐步减少，更加有效的加快了反应的速度并且提高了DNA的产量。cHDA法利用T7基因4蛋白使反应温度仅在25℃反应，因此在室温条件下即可完成扩增，不需要加热，操作更加简单方便。

目前已经有对腹泻性梭状芽胞杆菌用HDA方法检测的报道。但HDA这种新型的等温扩增技术受DNA解旋酶结合、延伸长度和解旋速度影响，模板靶序列超过400bp会显著降低扩增效率，DNA解旋酶对扩增效果影响很大，今后的研究重点将是如何筛选出优质的DNA解旋酶。