不同抗寒冬油菜品种过氧化物同工酶比较

次仁白珍

(西藏自治区农牧科学院农业研究所·西藏拉萨·850032)

不同抗寒冬油菜品种过氧化物同工酶比较

次仁白珍*

(西藏自治区农牧科学院农业研究所·西藏拉萨·850032)

本文利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了8份白菜型冬油菜的过氧化物酶同工酶的特性。结果表明:天油类与陇油类在逆境损伤下酶谱含量差异较大,陇油类的酶谱含量均高于天油类;天油类不同种间酶谱特征基本相同,而陇油类相比天油类而言,酶谱间均存有较大的差异。这说明陇油类的过氧化物同工酶抗逆性生理作用高于天油类。

油菜 过氧化物同工酶 聚丙烯酰胺凝胶电泳

冬油菜是我国北方地区重要的油料作物之一,对北方地区国民经济和农业生产具有深远意义。我区冬季昼夜温差大,甘蓝型冬油菜在我区种植很难成活,自引进白菜型冬油菜种植后,改变我区自10月份后耕地一片光秃现象,冬油菜的引种,不仅提高土地的利用效率和复种指数,同时还起到保护生态的作用,因此冬油菜的抗寒性至关重要。在生物学系统中常用形态学差异和特征,不能准确区分趋向同类还是本身同源,加之进化速度不稳定,稳定性也差,但如果提供数量足够的植物蛋白质用来顺序分析不仅困难增加,且耗资增大。因此应用同工酶技术可以简单可行的进行鉴别。

同工酶技术,是指用凝胶电泳的方法,将不同的同工酶酶谱带分离,经过染色形成深浅不一的酶带谱。已经成为作物物种起源、生长发育、遗传育种等相关领域的一项重要的研究工具,同时也可被用来鉴定生物基因型是否存在差异的相关工具[1]。同工酶是由结构基因编码,且同时能反映在酶谱上,具有明显的种间、属间、组织、发育阶段的特异性[2-4]。到目前为主,植物组织研究最多的是过氧化物酶同工酶,即被称为678同工酶。它在各种植物组织中普遍存在,是结构及生理性质不同的酶分子类型,但在生物体内催化反应作用相同,是基因表达的直接产物。在特定的生育期具有相对的稳定性和特异性,能够从蛋白质方面对种群关系和遗传变异进行相对客观的分析和比较[5-6]。同工酶普遍存在植物器官,目前仍被广泛利用的遗传标记,主要从蛋白质水平上显示种质资源或物种的遗传多样性。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和相关的染色反应,显示同工酶不同谱带,用于不同物种、同一物种不同品种之间的遗传差异鉴定,在物种特性和遗传多样性研究等领域有广泛的用途[7-8]。本文对我区引种种植的8份白菜型油菜的POD同工酶进行电泳分析,讨论POD同工酶经过冬天的逆境生理过程后酶谱的变化规律,为我区选育最合适的白菜型冬油菜种植及不同冬油菜的品种栽培、利用提供相关的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

试验材料:陇油系列类4份品种:陇油6号、陇油7号、陇油8号、陇油9号;天油系列类4份品种:天油5号、天油6号、天油7号、天油8号;于2013年8月在农科所试验基地播种,第二年返青后开始试验。

试验试剂:Tris、Bis、TEMED、盐酸、琼脂甘氨酸、蔗糖、乙酸钠、冰醋酸、过氧化氢、联苯胺、核黄素、溴酚蓝、抗坏血酸、去离子水等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备:返青后在3-4叶期取完好叶片,自封袋封装,冰壶带回。先用清水冲洗,再用去离子水冲洗,干净滤纸吸干表面水分后,将供试材料放于4℃冰箱12h保存。样液提取,每份材料称取叶片0.3 g,加3 m L同工酶提取液(即Tris12.0g,去离子水800ml,以HCl或者NaOH调节p H至7.8),加少许石英砂,冰浴研磨至匀浆。12000 r/min离心10 min,吸取上清液,分装后-20℃冰箱保存备用,提取试验3次重复。

1.2.2 制胶及电泳:采用聚丙烯酰胺双向凝胶电泳技术,灌胶分为分离胶和浓缩胶,其中分离胶质量浓度为0.08 g/m L、p H8.0,且分离胶缓冲液Tris-HCl、p H=8.0;浓缩胶质量浓度为0.04 g/m L、p H6.5,且浓缩胶缓冲液Tris-HCl、p H=6.5,电极缓冲液用p H8.0的Tris-Gly,上样量18-20μL,电泳过程采用恒压进行,浓缩胶120 V电泳约1 h,分离胶180V电泳约4 h,待溴酚蓝指示剂距离前沿胶底0.5 cm时,结束电泳。2-3次重复电泳试验。

1.2.3 染色及记录:电泳完毕后,先用乙酸缓冲液浸泡3min,然后倒去乙酸缓冲液,加抗坏血酸-联苯胺染色液,使淹没整个胶面,于摇床上显色15-20min,待出现过氧化物同工酶的红褐色酶谱。倒掉染色液,重新加入清水中观察记载。酶带记录从溴酚蓝前沿出现的第一条带开始命名为某酶代号-1,以此类推[9]。

1.2.4 电泳迁移率及酶带数的计算:同工酶谱带按照从阴极到阳极(从电泳胶面的上到下)的方法进行数字编号,统计每个品种各自的酶带数,计算各酶带的相对迁移率。相对迁移率的计算公式如下:酶带迁移率(Rf)=酶带迁移距离/溴酚蓝指示剂迁移距离[10]。同时按酶带的颜色深浅、宽度、相对迁移率以及酶带数绘制酶带模式图,标定酶带位置.

2 结果与分析

图1、图2分别为8份白菜型油菜过氧化物酶同工酶电泳图和电泳模式图,由图可以看出,不同抗寒类型的油菜电泳结果不同,品种间过氧化物酶的活性强度不同,出现的谱带有3-5各不相同,同一类型如天油类差异不显著,陇油类差异也不显著,而不同类型间天油类的品种和陇油类的品种相比,差异较大。

图1 8份白菜型油菜过氧化物酶同工酶电泳图

图2 8份白菜型油菜过氧化物酶同工酶电泳模式图

表1显示,天油类品种天油5号、天油6号、天油7号、天油8号的POD同工酶有Rf为0.38、0.51和0. 79的3条酶带,其酶谱特征也基本相似,不仅表现在酶带数目上一致,而且发现在电泳过程中酶带的显色速度较慢、颜色较浅、较窄和迁移速率较小。

陇油类品种陇油6号、陇油7号、陇油8号、陇油9号不同品种间的同工酶酶谱特征则存有差异,酶谱带出现3-5的变化,其中共有Rf为0.38、0.51和0.79的3条酶带。陇油6号有5条酶带,增加了Rf为0.14、0.75的两条酶带;陇油7号有4条酶带,增加了Rf为0.75的一条酶带;陇油8号仅有3条共有酶带;陇油9号有四条酶带,增加了Rf为0.14的一条酶带。其它的过氧化物酶带型基本一致,只在表达量上有差别。

天油类与陇油类品种共有Rf为0.38、0.51和0.79的3条酶带,但陇油类品种酶带的颜色较深、显色速度较快、酶带较天油类品种宽,这可能是由于不同品种间在基因上、抗寒性的差异,从而导致了酶带上过氧化物酶同工酶表达速度和表达量的差异。

表1 8份白菜型油菜过氧化物酶谱及相对迁移率

3 结论与讨论

3.1 结论

过氧化物(POD)同工酶作为植物保护酶系的重要保护酶之一,与植物的抗寒、抗旱、抗盐、抗病等方面的抗逆生理显著相关。过氧化物同工酶带的染色深浅、酶带宽窄可以反映同工酶含量多少,本文通过对白菜型冬油菜的天油类和陇油类品种中过氧化物(POD)同工酶酶谱比较,可以看出陇油类过氧化物(POD)同工酶谱带数、染色度均高于天油类,说明过氧化物(POD)同工酶在陇油类中的含量高于天油类。与天油类油菜品种相比,陇油类是强冬性冬油菜,能够适应比较恶劣生活环境,因此,笔者认为陇油类品种的抗逆生理作用高于天油类品种的抗逆性生理作用,这为天油类和陇油类在抗逆性生理保护作用的比较提供了一定的生化依据,在西藏地区、尤其是相对高海拔地区选用陇油类冬油菜品种进行种植,能显著提高油菜越冬率,增加成活性。

3.2 讨论

逆境诱导是过氧化物(POD)同工酶发挥作用的前提条件,在逆境中过氧化物同工酶显著提高有利于清除活性自由基氧,缓解不利环境和因素对植物自身构成的威胁,从而达到保护植物自身不被伤害目的。过氧化物同工酶也能反映不同品种间抗性和基因型的差异,但是不同人操作手法的差异也造成一定的误差。酶带随着染色时间的拉长和染色不正当操作,均会染色不成功,相关文献均有这方面的报道,但目前为止尚未找到解决这一问题的可行性策略,这可能是过氧化物酶同工酶染色时与冰醋酸挥发有很大关系,根据本文在试验过程中的操作,建议在配置相同比例的丙酮∶水溶液时丙酮略多有助于改善染色效果。另外,过氧化物酶染色可适当采用适当高温和摇床,染色效果会更佳。

[1]沙伟,孟凡玲,玛昌军.10个苜蓿品种过氧化物同工酶的分析[J].北方园艺,2007(1):150-152.

[2]陈默君,贾甚修.中国饲用植物志[M].北京:中国农业出版社,2002.

[3]任继周.主要牧草栽培及种子生产[M].成都:四川科学技术出版社,1986.

[4]王保仁,常桂菊,胡能书,等.湘矮型油菜“三系“及其杂交种过氧化物酶同工酶的初步研究[J].湖南农业科技,1980,(6):162～1.

[5]刘忠松,官春云.甘蓝型油菜玻里马细胞质雄性不育系与保持系的生化比较[J].中国油料,1990, (3):15～.

[6]李殿荣,王保仁.同工酶谱分析鉴定杂交油菜秦油2号种子纯度技术研究[J].陕西农垦科技,1992,2 (22):～28.

[7]刘忠松,官春云,陈社员.植物雄性不育机理的研究及应用[M].北京:中国农业出版社,2001.507～5.

[8]胡志昂,王洪新,阎龙飞$裸子植物的生化系统学(一)-松科植物的过氧化物酶[J]植物学报,1997 (4):423-430.

[9]王韶唐.植物理学实验指导[M].西安:陕西科技出版社,1986.44-48.

[10]邹春静,盛晓峰,韩文卿,等.同工酶分析技术及其在植物研究中的应用[J].生态学杂志,2003,22 (6):63-69.

Compare the POD of the Several Campestrises Damaged by the Low Temperature

Ciren baizhen
(Tibet Autonomous Region of Agricultural Research Institute,Lhasa,850032)

Take advantage of the PAGE polyacrylamide gelelectrophoresis of POD for 8 Species of campestris.The results indicated that:when the Tianyou and Longyou were damaged by low temperature.the difference of zymogram between the Tianyou and Longyou was obvious,the content of the Longyou were all exceed the Tianyou.The electrophoretograms of POD for four species of the Tianyou of the difference was lower,but the Longyou for four species had sharp distinction.The results state that stress tolerance of the the Tianyou was better than the Longyou.

campestris;peroxidase isozyme;PAGE polyacrylamide gelelectrophoresis

* 次仁白珍(1975-),女,藏族,副研究员。主要从事油菜栽培研究工作。联系电话:13989088341