长链非编码RNA母系表达基因3对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响

朱栋良，尹小平，王芳元

(咸宁市中心医院，同济咸宁医院肝胆胰胃肠外科，湖北 咸宁 437100)

长链非编码RNA母系表达基因3对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响

朱栋良，尹小平，王芳元△

(咸宁市中心医院，同济咸宁医院肝胆胰胃肠外科，湖北 咸宁 437100)

目的:检测长链非编码RNA母系表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)在结直肠癌细胞中的表达，并观察过表达MEG3对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响。方法:检测人正常结肠细胞NCM460及结直肠癌细胞SW48、LoVo中MEG3的水平，在SW48细胞和LoVo细胞中转染MEG3过表达质粒，利用Transwell小室及划痕实验观察过表达MEG3对细胞侵袭和迁移能力的影响，通过Western blotting检测基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族相关蛋白的变化。结果:结直肠癌细胞SW48和LoVo中MEG3的水平明显低于人正常结肠细胞NCM460;在SW48和LoVo细胞中过表达MEG3后能够明显抑制细胞的侵袭和迁移能力;Transwell侵袭实验和迁移实验显示MEG3表达组SW48细胞的穿膜数及LoVo细胞的穿膜数与对照组比较明显减少。划痕实验中过表达MEG3后细胞间距较对照组明显增大，提示细胞运动能力减弱。同时过表达MEG3可明显降低细胞中MMP－2及MMP－9的表达，增高金属蛋白酶组织抑制物2(tissue inhibitor of metalloproteinase－2，TIMP－2)的表达。结论:结直肠癌细胞中MEG3水平较正常结直肠细胞明显降低;在结直肠癌中过表达MEG3可抑制细胞的侵袭、迁移运动能力，并且可能通过影响TIMP－2、MMP－2及MMP－9的表达发挥上述功能。

长链非编码RNA;母系表达基因3;结直肠肿瘤;肿瘤侵袭;细胞迁移;基质金属蛋白酶

长链非编码RNA(long non－coding RNA，lncRNA)是一种长度大于200个核苷酸的非编码RNA，广泛存在于人类基因组中，根据目前的人类全基因组测序的结果推断，大概有20～40万种不同的lncRNA，数量约为编码基因的10～20倍。lncRNA可通过不同方式影响编码基因的表达量和功能，对细胞的生物学进程起调控作用［1－2］。母系表达基因3 (maternally expressed gene 3，MEG3)是目前发现lncRNA中的一个，其主要表达于正常大脑、骨髓、乳腺、子宫、肺及胃肠道组织中，而在多种恶性肿瘤中表达明显减低乃至缺失［3－5］。既往文献报道MEG3的表达抑制可能在胃癌的增殖中发挥重要的作用［6］，但MEG3在结肠癌中有何作用尚不明确。本研究拟利用人正常结肠细胞NCM460及人结直肠癌细胞SW48、LoVo观察MEG3对于结直肠癌细胞侵袭迁移的影响，并初步探索其中可能的机制。

材料和方法

1 细胞及试剂

人正常结肠细胞系NCM460及人结直肠癌细胞系SW48、LoVo购自中科院上海细胞库;抗MMP－2抗体、抗MMP－9抗体、抗TIMP－2抗体及抗GAPDH抗体(Cell Signalling);Transwell(8 μm孔径)及Matrigel等均购自武汉博士德生物有限公司;PCR引物由广州锐博生物有限公司设计并合成，其中MEG3的上游引物为5’－GGAGCTGTTGAGCCTTCAGT－3’，下游引物为5’－ATTGAGAGCACAGTGGGGTG－3’;U6的上游引物为5’－GACAGACCCTCACTACTG－3’，下游引物为5’－GATAGTACATGACAAGCTGC－3’;MEG3过表达质粒由武汉擎科生物有限公司设计并合成。

2 实验方法

2.1 细胞培养NCM460、SW48及LoVo 3种细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI－1640培养基中，置于37℃、5%CO2温箱内常规传代培养。

2.2 实时荧光定量PCR(real－time PCR)检测NCM460、SW48及LoVo中MEG3的表达收集1× 106细胞，通过Trizol一步法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，应用上述引物行PCR扩增，ABI 7300检测并分析各细胞中MEG3的水平。

2.3 Transwell侵袭实验利用脂质体对SW48细胞及LoVo细胞常规转染MEG3过表达质粒，使其中的MEG3高表达，转染空质粒作为阴性对照。收集转染后的各组细胞，重悬于无血清RPMI－1640培养液，以每孔5×104加入到预铺好Matrigel的Transwell小室上室内，下室加入500 mL完全培养液，置于37°C、5%CO2的细胞培养箱中培养24 h后多聚甲醛固定，0.01%结晶紫染色，200倍光学显微镜下计数穿膜细胞数，随即取5个视野，取平均值，每组实验设3个复孔，实验重复3次。

2.4 Transwell迁移实验利用上述转染后收集的各组细胞，重悬于无血清RPMI－1640培养液，以每孔5×104加入到Transwell小室上室内，下室加入500 mL完全培养液，置于37°C、5%CO2的细胞培养箱中培养24 h后多聚甲醛固定，0.01%结晶紫染色，200倍光学显微镜下计数穿膜细胞数，随即取5个视野，取平均值，每组实验设3个复孔，实验重复3次。2.5细胞划痕运动实验将SW48细胞及LoVo细胞按照每孔5×105接种于6孔板中，按照上述实验分组转染48 h后，细胞融合度达到95%以上，用无菌Tip头部划线，置于37°C、5%CO2的细胞培养箱中培养24 h后光学显微镜下拍照，随即取5个视野，测量划痕两侧细胞间距取平均值，每组实验设3个复孔，实验重复3次。

2.6 免疫印迹(Western blotting)实验收集上述转染后的各组细胞，裂解获取细胞总蛋白，各样品通过BCA法检测蛋白浓度，各蛋白样品按照上述检测所得浓度分别取50 μg行聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF膜转膜并用脱脂奶粉封闭非特异性结合，然后依次孵育I抗及II抗最后用ECL显色液显影检测细胞中MMP－2、MMP－9及TIMP－2的表达，以GAPDH作为内参照，结果通过ImageJ进行灰度值分析并通过统计学检验，实验重复3次。

3 统计学方法

用SPSS 12.0统计学软件进行统计分析。实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 MEG3在结直肠癌细胞中表达明显减少

通过real－time PCR检测NCM460、SW48及LoVo细胞中MEG3的表达，利用U6作为内参照，结果提示相对于正常结肠细胞NCM460，结直肠癌细胞SW48细胞及LoVo细胞中MEG3的水平明显降低，而通过外源性转染过表达质粒可以明显恢复细胞中MEG3的水平，见图1。

2 过表达MEG3抑制结直肠癌细胞侵袭

按上述分组将转染后的细胞接种于预铺Matri gel的Transwell小室中检测其侵袭能力。结果提示高表达MEG3的SW48细胞其穿膜细胞数为(33± 7)个/视野，相比对照组［(228±11)个/视野)］显著减少(P＜0.05);高表达MEG3的LoVo细胞其穿膜细胞数为(28±5)个/视野，相比对照组［(198± 17)/视野)］显著减少(P＜0.05)，见图2。

Figure 1.The expression of MEG3 was detected in colorectal cancer cells，and MEG3 was over－expressed by plasmid transfection.A: the expression of MEG3 in NCM460，SW48 and LoVo cells;B，C:MEG3 was over－expressed by plasmid transfection in SW48 and LoVo cells，respectively.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NCM460 or control.图1 检测MEG3在结肠癌细胞中的表达水平并通过转染质粒过表达MEG3

Figure 2.Over－expression of MEG3 inhibited the invasion of colorectal cancer cells observed by Transwell assay with Matrigel(×400).图2 过表达MEG3抑制结肠癌细胞的侵袭能力

3 过表达MEG3抑制结直肠癌细胞迁移

按上述分组将转染后的细胞直接接种于Transwell小室中检测其迁移能力，结果提示，高表达MEG3的SW48细胞其穿膜细胞数为(46±6)个/视野，相比于对照组［(341±16)个/视野］显著减少(P＜0.05);高表达MEG3的LoVo细胞其穿膜细胞数为(39±3)个/视野，相比对照组［(263±10)个/视野)］显著减少(P＜0.05)，见图3。

Figure 3.Over－expression of MEG3 inhibited the migration of colorectal cancer cells observed by Transwell assay (×400).图3 过表达MEG3抑制结肠癌细胞的迁移能力

4 过表达MEG3抑制结直肠癌细胞运动

将SW48细胞及LoVo细胞分别接种于6孔板，转染MEG3过表达质粒后行细胞划痕，24 h后普通光学显微镜观察结果提示，SW48细胞及LoVo细胞高表达MEG3后，与对照相比，划痕两侧细胞间距明显增大，细胞的运动能力减弱，见图4。

5 过表达MEG3抑制基质金属蛋白酶家族相关蛋白的表达

将上述细胞裂解提取总蛋白后行Western blotting检测发现，高表达MEG3后MMP－2和MMP－9的表达明显降低(P＜0.05)，而TIMP－2的表达增高(P＜0.05)，见图5。

Figure 4.Over－expression of MEG3 inhibited the mobility of colorectal cancer cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.图4 过表达MEG3抑制结肠癌细胞的运动能力

Figure 5.The effect of MEG3 on the expression of MMP family proteins in colorectal cancer cells detected by Western blotting.Mean ±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.图5 过表达MEG3对基质金属蛋白酶家族蛋白表达的影响

讨论

随着人类基因组计划的完成，人们发现基因组中除了大约20 000个蛋白编码基因，还同时含有大量的非编码RNAs(non－coding RNAs，ncRNAs)。ncRNAs本身虽不能编码蛋白质，但能通过多种方式调控编码基因的表达和功能，近数10年来针对ncRNAs的研究多集中在microRNAs上，并取得了诸多研究成果［7－10］，但对于序列长度超过200核苷酸的lncRNAs的研究尚刚刚起步。lncRNAs的序列长度长于microRNAs，其调控基因表达和功能的方式也与microRNAs迥异，不仅可以影响蛋白翻译发挥转录后调控，还可通过影响基因的转录活性及蛋白降解等多种途径发挥功能。既往研究发现，MEG3作为一种印迹基因编码的lncRNA，在胚胎发育及多种正常细胞中均有明显表达，但在垂体瘤、肝细胞癌、卵巢癌等多种肿瘤中表达明显降低或缺失，而且MEG3的表达降低与胃癌的临床预后不佳相关，MEG3还可以通过调控P53的表达影响非小细胞肺癌的增殖和凋亡［3－6］。但MEG3在结直肠癌细胞的表达及功能尚不十分明确。

我们的研究发现，MEG3在结直肠癌细胞的表达明显低于正常结肠细胞，提示MEG3的表达抑制可能参与结直肠癌的发生。结直肠癌细胞最重要的恶性行为即具有高度的侵袭转移能力，所以我们进一步在结直肠癌细胞中通过转染MEG3过表达质粒恢复其表达，观察过表达MEG3对于细胞侵袭迁移能力的影响。而Transwell侵袭、迁移实验及细胞划痕运动实验均证实过表达MEG3可以明显抑制肿瘤细胞的侵袭、迁移能力，提示MEG3不仅参与结直肠癌的发生，更有可能与结直肠癌细胞的侵袭迁移相关。为了明确MEG3通过何种机制促进肿瘤细胞侵袭迁移能力，我们通过Western blotting检测基质金属蛋白酶家族相关基因的表达。基质金属蛋白酶是目前公认的调控肿瘤侵袭转移的关键基因，不同类型的基质金属蛋白酶表达增高或者活性升高，抑或TIMP－2等基质金属蛋白酶抑制物的下调都能促进肿瘤的侵袭转移。我们发现过表达MEG3可以显著抑制MMP－2及MMP－9的表达，而上调TIMP－2的表达，从而为MEG3调控结直肠癌细胞的侵袭迁移提供了可能的理论依据。

综上所述，我们的研究发现，在结直肠癌细胞中MEG3的表达明显降低，在结直肠癌细胞中过表达MEG3可抑制细胞的侵袭、迁移及运动能力。同时过表达MEG3后基质金属蛋白酶家族蛋白明显变化，提示MEG3可能通过其调控结直肠癌的侵袭转移。本文提示MEG3在结直肠癌的发生发展发挥重要作用，为结直肠癌的临床治疗提供了新的药物靶点及监测指标。

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Effect of long non-coding RNA MEG3 on invasion and migration of colorectal cancer cells

ZHU Dong－liang，YIN Xiao－ping，WANG Fang－yuan

(Department of General Surgery，Xianning Central Hospital，Tongji Xianning Hospital，Xianning 437100，China.E-mail: xnzxyywfy@126.com)

AIM:To investigate the expression of long non－coding RNA maternally expressed gene 3(MEG3) in colorectal cancer(CRC)cells，and to observe the effect of MEG3 on the invasion and migration of CRC cells.METHODS:The levels of MEG3 in human normal colon cell NCM460 and CRC cells SW48 and LoVo were detected by real－time PCR.MEG3 was over－expressed by plasmid transfection，and the effects of MEG3 on the invasion and migration of SW48 and LoVo cells were analyzed by Transwell assay and wound healing assay.The expression of matrix metalloproteinase (MMP)family proteins was determined by Western blotting.RESULTS:The level of MEG3 was down－regulated in CRC cells compared with normal colon cell NCM460.The invasion and migration of CRC cells were reduced after MEG3 over－expression.Transwell invasion and migration assays showed that the numbers of transmembrane SW48 and LoVo cells were smaller in MEG3 over－expression group than control group(P＜0.05).The cell spaces were broader after MEG3 over－expression in the wound healing assay，indicating that MEG3 over－expression inhibited the mobility of CRC cells.Meanwhile，over－expression of MEG3 reduced the expression of MMP－2 and MMP－9，and elevated the expression of tissue inhibitor of metalloproteinase－2(TIMP－2).CONCLUSION:The expression of MEG3 is down－regulated in CRC cells.Over－expression of MEG3 inhibits the invasion and migration of CRC cells.TIMP－2，MMP－2 and MMP－9 might play an important role in this regulation.

Long non－coding RNA;Maternally expressed gene 3;Colorectal neoplasms;Neoplasm invasiveness;Cell migration;Matrix metalloproteinase

R735.3+4

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.019

1000－4718(2015)02－296－05

2014－09－17

2014－11－24

△通讯作者Tel:0715－8896278;E－mail:xnzxyywfy@126.com