大鼠肢体缺血-再灌注后脑CBS表达的变化及意义*

王瑜玲，马华民，王冰，张彦，黄新莉

(河北医科大学第三医院1神经内科，2药剂科，河北 石家庄 050051;3河北医科大学病理生理教研室，河北 石家庄 050017)

大鼠肢体缺血-再灌注后脑CBS表达的变化及意义*

王瑜玲1，马华民2，王冰1，张彦1，黄新莉3△

(河北医科大学第三医院1神经内科，2药剂科，河北 石家庄 050051;3河北医科大学病理生理教研室，河北 石家庄 050017)

目的:观察肢体缺血－再灌注(IR)后脑组织内胱硫醚β－合酶(CBS)表达的变化及意义。方法:夹闭大鼠腹主动脉下段4 h、开放3～24 h复制肢体IR模型。采用逆转录多聚酶链反应检测脑内CBS mRNA表达的变化;Western blotting法检测脑内CBS蛋白的表达;采用全自动酶标仪测定脑组织中CBS活性和硫化氢含量;采用CBS抑制剂羟胺抑制CBS活性后，光镜观察脑组织的病理学变化。结果:肢体IR后脑组织CBS mRNA和蛋白表达水平明显高于假手术组，再灌12 h表达至峰值(均P＜0.01)，再灌注至24 h与假手术组比较无显著差异(均P＞0.05)。肢体IR后脑组织中CBS活性及硫化氢浓度的变化与CBS mRNA和蛋白表达的变化一致;与假手术组相比，单纯缺血组上述各指标均没有明显变化(均P＞0.05);肢体IR后抑制CBS活性，IR组脑组织损伤加重。结论:肢体IR后，脑组织中CBS表达上调，所诱生的CBS对神经元具有保护效应。

脑;四肢;再灌注损伤;胱硫醚β－合酶;硫化氢

硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是继一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)之后被发现的另一种具有神经调质作用的新型气体信号分子［1］，在神经系统多种生理和病理生理过程中发挥着重要作用。有研究发现，内源性H2S在全脑缺血－再灌注(ischemia－reperfusion，IR)的发生、发展过程中呈动态变化，并可能在缺血－再灌注早期发挥作用［2］。

局部器官IR是引发多器官功能衰竭的原因之一，我们曾以肢体IR大鼠为模型证实，外周器官IR可致脑组织损伤［3］。虽已有研究证实，气体信号分子NO和CO均参与了肢体IR脑损伤的发生、发展过程，但目前其发生机制尚不完全清楚。而与NO和CO在多种生理、病理生理过程中具有极为相似特性的H2S，是否也参与了肢体IR脑损伤的发生、发展过程?其作用如何?基于以上疑问，本研究动态观察了H2S在肢体IR大鼠脑组织中的变化，并进一步给予大鼠H2S合成酶胱硫醚β－合成酶(cystathionine βsynthase，CBS)抑制剂羟胺(hydroxylamine，HA)，造成脑内源性H2S浓度降低，通过观察不同新生大鼠脑组织形态学变化，为探索H2S在肢体IR脑损伤中的作用提供依据。

材料和方法

1 材料

Trizol RNA提取试剂为Invitrogen产品;逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶及dNTP购自Promega;CBS和β－actin引物由北京赛百盛公司合成;兔抗大鼠CBS和小鼠抗大鼠β－actin多克隆抗体均为Santa Cruz的产品;原位凋亡检测试剂盒购自华美生物公司;其它试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 动物模型的复制［4］采用体重为200～250 g的健康SD雄性大鼠(河北省实验动物中心提供)，25%乌拉坦(1.0 g/kg，ip)麻醉，每隔6 h追加1/3～1/2剂量，维持麻醉。分离气管进行插管，分离颈外静脉插管以补液(静脉点滴生理盐水1 mL/h)。分离腹主动脉下段，在髂总动脉分出前，用无创血管夹(宁波显微器械厂)夹闭腹主动脉，使双下肢完全缺血，4 h后松开血管夹使肢体血流再灌注。应用激光多普勒(Perimed)探测血流以保证肢体的缺血和再灌注。

2.2 实验分组将56只SD大鼠随机分为4组: (1)假手术(sham)组，进行同样的麻醉及手术只是不进行血管夹闭;(2)单纯缺血(I)组，夹闭血管使肢体缺血4 h;(3)IR组，使肢体缺血4 h后松开血管夹使肢体血液再灌注，根据再灌注时间又分为再灌注3、6、12及24 h组;(4)HA组，夹闭腹主动脉4 h，去夹再灌注到6 h时，腹腔注射CBS抑制剂HA (12.5 mg/kg)，再灌注到12 h。实验结束时处死大鼠开颅取脑，分离出双侧脑组织(大脑皮层和海马)进行下述指标检测。

2.3 脑组织中总RNA的提取和CBS mRNA的RTPCR脑组织总RNA提取操作按照Trizol试剂说明书进行。琼脂糖凝胶电泳观察28 S和18 S条带，测260 nm/280 nm吸光度值并定量后于－80℃保存。CBS mRNA水平以β－actin为内参照，根据逆转录试剂盒步骤逆转录合成cDNA第1条链。聚合酶链反应体系如下:10×PCR缓冲液5 μL，MgCl2(25 mmol /L)3 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，上游引物(50 pmol/L)1 μL，下游引物(50 pmol/L)1 μL，模板DNA 1 μg，DNA聚合酶(5×106U/L)0.5 μL，灭菌双蒸水补至50 μL。反应条件:94℃2 min;随后以94℃1 min，50℃1 min，72℃1 min，循环30次;最后72℃5 min。CBS引物序列上游为5’－GAA CCA GAC GGA GCA AAC AG－3’，下游为5’－TGT AGA GGA CTT TGC AGA CT－3’，扩增片段大小为572 bp;β－actin引物序列上游为5’－ATG GAT GAC GAT ATC GCT GCG－3’，下游为5’－TCG TCC CAG TTG GTG ACA ATG－3’，扩增片段大小为227 bp。每份样品的PCR均重复4次。以灭菌双蒸水代替cDNA作为阴性对照。PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色后，凝胶成像照相。用Bandscan 5.0凝胶图像处理软件进行灰度分析，以CBS与β－actin的扩增产物条带灰度值之比作为反映CBS的mRNA相对表达量。

2.4 Western blotting实验脑组织称重，加入组织裂解液(10%W/V)(50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、1%Triton X－100、0.5%脱氧胆酸钠、1 mmol/L PMSF、0.1%SDS、10 mmol/L NaF、1 mmol/L钒酸钠、40 mg/L蛋白酶抑制剂混合物)于4℃下匀浆，4℃、12 000×g离心10 min，吸取上清，以考马斯亮蓝G250法进行蛋白定量后将制备好的蛋白样品置－80℃冰箱保存备用。各组取50 μg样品蛋白行12%SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(100 V，3 h)后转入硝酸纤维素膜。应用3%脱脂奶粉室温封闭硝酸纤维素膜1 h，分别加入CBS与β－actin的I抗溶于0.5%抗体稀释液中(1∶1 000)，4℃密封过夜。TPBS振荡洗膜后，应用辣根过氧化物酶标记的II抗及DAB显色试剂盒进行检测，以出现棕黄色条带为阳性结果。用GDS凝胶图像处理系统分别分析CBS蛋白条带的IA值和β－actin蛋白的IA值，以CBS与β－actin蛋白的IA比值代表CBS蛋白的相对表达量。2.5脑组织中CBS活性测定参照文献［5］报道的方法，并进行适当改良。反应在25 mL锥形瓶中进行，反应体积1 mL，含50 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)、10 mmol/L的L－半胱氨酸、2 mmol/L的5’－磷酸吡哆醛和12%W/V脑组织匀浆。在中央室中加入1%的0.5 mL醋酸锌，放入滤纸(0.5 cm×1.5 cm)增加吸收面积。用氮气将锥形瓶充盈30 s后石蜡膜封口，转移到37℃水浴摇床中开始反应，90 min后向其中注入0.5 mL的50%三氯乙酸中止反应，继续水浴60 min后向中央室内加入50 μL的N，N－二甲基对苯二胺盐酸盐(20 mmol/L)/HCl(7.2 mol/L)缓冲液及50 μL的FeCl3(30 mmol/L)/HCl(112 mol/ L)缓冲液。充分混匀。20 min后，用全自动酶标仪在波长670 nm测定吸光度，根据H2S标准曲线计算溶液中H2S浓度，组织中CBS活性以单位重量的脑组织在单位时间内生成H2S的量(nmol·g－1·h－1)表示。

2.6 脑组织中H2S含量测定参照文献［6］用0～4℃的50 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)制备匀浆(12%W/V)，匀浆液离心(12 000×g、10 min、4℃)，取75 μL上清液移至另一离心管中，在室温下加入0.25 mL的1%醋酸锌及0.45 mL蒸馏水孵育10 min，然后加入10%三氯乙酸0.25 mL，再次离心12 000×g、10 min、4℃)，收集清澈的上清液，加入133 μL的N，N－二甲基对苯二胺盐酸盐(20 mmol/L)/ HCl(7.2 mol/L)缓冲液及133 μL的FeCl3(30 mmol/L)/HCl(1.2 mol/L)缓冲液，充分混匀。20 min后，用全自动酶标仪在波长670 nm测定吸光度，根据H2S标准曲线计算溶液中的H2S含量，H2S含量以单位重量的脑组织中H2S的量(nmol/g)表示。2.7脑组织学检查实验结束时，取大鼠脑组织，10%中性甲醛固定，石蜡包埋，制成5 μm厚切片，常规HE染色，进行光镜观察。

2.8 海马神经元凋亡检测采用TUNEL方法。脑组织石蜡切片常规脱蜡至水，依次加入蛋白酶K、TUNEL反应混合液和辣根过氧化物酶，DAB显色，苏木精复染。凋亡细胞核染色呈棕褐色。

3 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 11.5软件进行统计分析。组间差异用单因素方差分析(one－way ANOVA)，并用Student－Newmen－Kuels q检验进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义

结果

1 脑组织中CBS mRNA表达的变化

假手术组和单纯缺血组大鼠脑组织中CBS mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05)。与假手术组相比，肢体缺血再灌注3 h后脑组织CBS的mRNA表达开始上调(P＜0.05)，再灌注6 h上调明显(P＜0.01)，再灌注12 h表达至峰值(P＜0.01)，再灌注至24 h与假手术组比较无显著差异(P＞0.05)，见图1。

Figure 1.The mRNA expression of CBS at different time points in rat brain tissues after limb IR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs IR 3 h group;△P＜0.05 vs IR 6 h group.图1 大鼠肢体缺血-再灌注各时点脑组织CBS mRNA的表达

2 脑组织中CBS蛋白表达的变化

Western blotting实验结果显示，假手术组和单纯缺血组大鼠脑组织中CBS蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)。与假手术组相比，肢体缺血再灌注3 h后，大鼠脑组织中CBS蛋白表达无明显变化(P＞0.05)，再灌注6 h后脑组织CBS蛋白表达开始上调(P＜0.05)，再灌注12 h上调至峰值(P＜0.01)，24 h时恢复至正常水平(P＞0.05)，见图2。

Figure 2.The protein expression of CBS at different time points in rat brain tissues after limb IR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05 vs IR 6 h group.图2 大鼠肢体缺血-再灌注各时点脑组织CBS蛋白的表达

3 脑组织中CBS活性和H2S含量的变化

假手术组和单纯缺血组大鼠脑组织中H2S含量和CBS活性差异均没有统计学意义。与假手术组相比，肢体缺血再灌注3 h和6 h后，大鼠脑组织中CBS活性和H2S含量均无明显变化，再灌注12 h后大鼠脑组织中H2S含量及CBS活性均显著升高(均P＜0.01);而IR 24 h组大鼠逐渐恢复正常水平，与假手术组相比没有明显差异，见图3、4。

Figure 3.The change of CBS activity in rat brain tissues after limb IR.Mean±SD.n=8.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs IR 12 h group.图3 大鼠肢体缺血-再灌注时脑组织中CBS活性变化

Figure 4.The change of H2S concentration in rat brain tissues after limb IR.Mean±SD.n=8.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs IR 12 h group.图4 大鼠肢体缺血-再灌注时脑组织中H2S含量变化

Figure 5.Microphotographs showing structural changes in cerebral cortex of rats from different groups(HE staining，×400).图5 光镜下各组大鼠大脑皮质的组织形态学改变

Figure 6.Microphotographs showing structural changes in hippocampus of rats from different groups(HE staining，×400).图6 光镜下各组大鼠海马的组织形态学改变

4 脑组织形态学的变化

光镜观察显示:假手术组脑组织结构清晰，无明显异常。单纯缺血组脑组织病变轻微，仅见个别神经元胞体、胞核增大，着色变浅。IR组与假手术组相比，大脑皮质和海马锥体层部分神经元胞体、胞核增大，着色变浅，部分神经元胞体明显变小，着色加深，细胞周围出现水肿裂隙。应用HA抑制CBS活性，可使脑组织中H2S组含量降低的同时，光镜下发现HA组较IR组病变进一步加重，固缩的神经元数目增多，海马放射层纤维明显水肿，纹理模糊不清，见图5、6。

5 海马神经元凋亡数目的变化

TUNEL染色显示，假手术组和单纯缺血组偶有TUNEL阳性细胞，两组阳性细胞数相比没有显著差异(P＞0.05)。IR组可见大量棕黄色着色的TUNEL阳性细胞，阳性细胞数与假手术组相比，TUNEL阳性细胞数量明显增加(P＜0.01)。应用HA抑制CBS活性，可使脑组织中H2S组含量降低的同时，光镜下发现HA组较IR组病变进一步加重，TUNEL阳性神经元数与脑缺血组相比明显增多(P＜0.01)，见图7。

Figure 7.The changes of TUNEL staining－positive cell number in hippocampus of rats.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs IR 12 h group.The scale bar=21.2 μm.图7 TUNEL染色结果

讨论

H2S是公认的第3种气体信号分子，在神经系统发挥重要的生理作用。内源性H2S是由含硫氨基酸被磷酸吡多醛－5’－磷酸依赖性酶［包括CBS、胱硫醚γ－裂解酶(cystathionine γ－lyase，CSE)］、半胱氨酸转移酶等催化产生的。其中，CBS高度表达于神经系统［7］，是脑内产生H2S的主要酶，CBS基因敲除后的小鼠脑内几乎测不到H2S，改变CBS的活性可以调节H2S的生成［8］，所以本研究检测了脑组织中CBS表达和活性的变化。在脑组织中，大脑皮质和海马神经细胞对缺血、缺氧损伤最敏感，故本研究选择大脑皮层和海马组织。结果显示，大鼠肢体IR后脑组织CBS mRNA与蛋白的表达水平明显上调，活性明显增强，脑组织内H2S生成明显增多。并且发现，肢体IR脑组织中CBS/H2S体系的表达上调呈时间依赖性。

肢体缺血是一种常见的临床病征，再灌注可能加重局部组织的损伤，严重时尚可造成远隔器官如脑的损伤。目前认为此种脑损伤的发生与氧化应激有关［9］。肢体IR后，血液中超氧阴离子等各种自由基含量急剧上升，同时脑组织内诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)及其产物NO被大量诱生，NO与超氧阴离子快速结合生成氧化性更强的过氧亚硝基阴离子(ONOO－)，使肢体IR引发的自由基反应在脑内被扩展加强［10］。针对氧化性损伤，组织细胞可产生多种抗氧化酶。其中血红素氧合酶(heme oxygenase，HO)亚型HO－1是细胞对抗应激反应和抗氧化损伤的重要组成部分，我们以往的研究证实，肢体IR时脑内HO－1被激活并参与了抗损伤的过程。据此，我们认为肢体IR所致脑组织损伤是一种过氧化损伤，以HO－1被激活类似，脑组织表达CBS也是针对氧化损伤的应激反应。

目前多项离体研究发现，H2S作为一种内源性的抗氧化剂，在氧化应激时能够清除羟自由基等活性簇，对神经细胞起保护作用;还能保护神经元免受兴奋性氨基酸(谷氨酸)、过氧化亚硝酸基和次氯酸导致的氧化应激［11］。Kimura等［12］通过对原代培养的皮质神经元研究发现，H2S以一种剂量依赖的方式保护神经元免受谷氨酸的氧化毒性，发挥抗氧化应激的作用，并且发现H2S不是直接作为抗氧化剂来发挥作用的，而是通过增加细胞内抗氧化剂谷胱甘肽的合成，保护神经元免受氧化应激。对于培养HT22细胞株，H2S除了使细胞内谷胱甘肽水平升高之外，还能通过激活ATP敏感的钾通道和氯通道保护神经元免受谷氨酸的氧化毒性作用。Whiteman等［13］已经研究证明，在培养的SH－SY5Y细胞中，H2S具有和还原型谷胱甘肽类似的作用，能以浓度依赖方式抑制过氧化亚硝酸介导的酪氨酸硝化。

脑组织中CBS/H2S体系在肢体缺血－再灌注过程中发生了动态变化，那么H2S在此过程中起保护作用还是损伤作用?本实验在CBS/H2S体系表达上调的高峰点(再灌注12 h)用工具药羟胺(HA)抑制CBS活性，发现脑组织中H2S的生成明显减少，同时导致肢体IR所引起的脑组织损伤(结构损伤及海马神经元凋亡)加重，包括光镜下的结构损伤及出现海马神经元的凋亡。这提示外周器官IR损伤对脑组织CBS表达具有诱导作用，脑组织所诱生的CBS具有细胞保护效应，寻求无创性手段主动调控CBS表达水平，可为防治器官IR引发多器官功能障碍提供新的对策。同时，有研究表明，外源性H2S通过抑制iNOS/NO、激活HO－1/CO减轻了大鼠脑缺血－再灌注损伤［14］，我们将会进一步研究H2S在肢体IR脑损伤过程中的抗氧化应激机制。

［1］Rui W.Two’s company，three’s a crowd:can H2S be the third endogenous gaseous transmitter?［J］.FASEB J，2002，16(13):1792－1798.

［2］Ren C，Du A，Li D，et al.Dynamic change of hydrogen sulfide during global cerebral ischemia－reperfusion and its effect in rats［J］.Brain Res，2010，1345:197－205.

［3］史中立，凌亦凌，姚玉霞，等.大鼠肢体缺血－再灌注后脑HO－1表达的变化及意义［J］.中国病理生理杂志，2003，19(4):448－451.

［4］Bianco－Batlles MD，Sosunov A，Polin RA，et al.Systemic inflammation following hind－limb ischemia－reperfusion affects brain in neonatal mice［J］.Dev Neurosci，2008，30(6):367－373.

［5］Zhang L，Pan C，Yang B，et al.Enhanced expression of cystathionine β－synthase and cystathionine γ－lyase during acute cholecystitis－induced gallbladder inflammation［J］.PLoS One，2013，8(12):e82711.

［6］Tang XQ，Zhuang YY，Zhang P，et al.Formaldehyde impairs learning and memory involving the disturbance of hydrogen sulfide generation in the hippocampus of rats［J］.J Mol Neurosci，2013，49(1):140－149.

［7］Pong WW，Stouracova R，Frank N，et al.Comparative localization of cystathionine beta－synthase and cystathionine gamma－lyase in retina:differences between amphibians and mammals［J］.J Comp Neurol，2007，505(2):158－165.

［8］Eto K，Ogasawara M，Umemura K，et al.Hydrogen sulfide is produced in response to neuronal excitation［J］.J Neurosci，2002，22(9):3386－3391.

［9］Kimura H.Production and physiological effects of hydrogen sulfide［J］.Antioxid Redox Signal，2014，20(5): 783－793.

［10］Iadecola C，Zhang F，Xu X.Inhibition of inducible nitric oxide synthase ameliorates cerebral ischemic damage［J］.Am J Physiol，1995，268(1 Pt 2):R286－R292.

［11］Xiao L，Lan A，Mo L，et al.Hydrogen sulfide protects PC12 cells against reactive oxygen species and extracellular signal－regulated kinase 1/2－mediated downregulation of glutamate transporter－1 expression induced by chemical hypoxia［J］.Int J Mol Med，2012，30(5):1126－1132.

［12］Kimura Y，Dargusch R，Schubert D，et al.Hydrogen sulfide protects HT22 neuronal cells from oxidative stress［J］.Antioxid Redox Signal，2006，8(3－4):661－670.

［13］Whiteman M，Cheung NS，Zhu YZ，et al.Hydrogen sulphide:a novel inhibitor of hypochlorous acid－mediated oxidative damage in the brain?［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，326(4):794－798.

［14］邵建林，王俊科，马虹.外源性硫化氢对脑缺血再灌注损伤大鼠海马气体信号分子的影响［J］.中华麻醉学杂志，2007，27(5):451－454.

Changes of CBS expression in brain following ischemia and reperfusion of limbs

WANG Yu－ling1，MA Hua－min2，WANG Bing1，ZHANG Yan1，HUANG Xin－li3

(1Department of Neurology，2Department of Pharmacy，The Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China;3Department of Pathophysiology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China.E-mail:huangxinli2008@126.com)

AIM:To detect the changes of cystathionine β－synthase(CBS)expression in the brain following ischemia－reperfusion of hind limbs in the rats and to elucidate their significance.METHODS:Hind limb ischemia was induced by clamping infrarenal aorta with a microvascular clip and brain injury was made by following reperfusion.The brain tissue was obtained from the animals subjected to sham operation，4 h of ischemia without reperfusion and 3 h，6 h，12 h，24 h of reperfusion following 4 h of ischemia.The expression of CBS at mRNA and protein levels was measured at different time points by reverse transcription－polymerase chain reaction(RT－PCR)and Western blotting.The CBS activity and hydrogen sulfide(H2S)concentration in the brain were determined by a universal microplate reader.The observation of pathologic changes of the brain was made following the inhibition of CBS by hydroxylamine.RESULTS:The relative expression of CBS at mRNA and protein levels in IR group significantly increased compared with sham group.It reached a peak at 12 h(P＜0.01)，and returned to baseline at 24 h(P＞0.05).This time course correlated with increased CBS activity and H2S concentration.No statistically significant difference in the above indexes between sham operation group and ischemia group was observed(P＞0.05).Inhibition of CBS activity induced more severe brain injury in IR group.CONCLUSION:Up－regulation of CBS/H2S pathway is involved in the protection for neurons during the ischemia－reperfusion of hind limbs.

Brain;Extremities;Reperfusion injury;Cystathionine β－synthase;Hydrogen sulfide

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.004

1000－4718(2015)02－213－06

2014－09－22

2014－11－05

国家自然科学基金资助项目(No.30800440);河北省自然科学基金资助项目(No.C2008001040;No.H2012206009;No.H2014206093188)

△通讯作者Tel:0311－86265645;E－mail:huangxinli2008@126.com