人脐带间充质干细胞定向诱导分化成类神经元的实验研究*

周志刚，李志忠，林永新，邵建立，焦根龙，孙国栋，周孝斌，丁志勇

(暨南大学附属第一医院骨科，广东 广州 510630)

人脐带间充质干细胞定向诱导分化成类神经元的实验研究*

周志刚，李志忠△，林永新，邵建立，焦根龙，孙国栋，周孝斌，丁志勇

(暨南大学附属第一医院骨科，广东 广州 510630)

目的:采用不同细胞因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化成类神经元，为脐带间充质干细胞移植治疗脊髓损伤提供理论依据。方法:采用Ⅱ型胶原酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞，采用流式细胞术鉴定细胞。取第5代细胞随机分成A、B、C、D 4组，在A组基础培养基中加入bFGF，B组中加入bFGF和BDNF，C组中加入bFGF、BDNF和BHA诱导培养，D组为对照组，使用含有10%胎牛血清的DMEM－F12培养基培养。诱导2周后采用实时荧光定量PCR检测细胞的nestin、NEFH和GFAP mRNA表达情况，并通过原子力显微镜观察细胞超微结构的的变化。结果:Ⅱ型胶原酶消化法能成功分离人脐带间充质干细胞。通过流式细胞术检测第3代细胞发现，细胞均强表达CD29、CD44和CD105，而CD34、CD45和HLA－DR均未见表达。经定向诱导分化成类神经元后，原子力显微镜观察细胞表面突起增多，实时荧光定量PCR检测显示nestin在A、B、C组均呈阳性表达，NEFH在A、B组呈阳性表达，而GFAP在A、B、C、D 4组均不表达。A、B组nEFH和nestin表达具有显著差异(P＜0.05)。结论:本实验成功分离培养人脐带间充质干细胞，所培养的细胞扩增迅速，生物学性状稳定;与bFGF单独处理相比，bFGF联合BDNF更能有效诱导人脐带间充质干细胞分化成类神经元。

脐带间充质干细胞;分化;神经元样细胞

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)主要是车祸或坠落伤所致，因其呈高发生率、高致残率、高耗费、低死亡率的特点而成为全球性医疗和社会共同关注的问题。目前SCI尚无有效的临床治疗对策，仍然是医学科学领域中一个极具挑战性的课题［1］。干细胞移植治疗SCI是近年来研究热点，主要是通过细胞移植来促进变性神经元的再生和抑制胶质瘢痕形成，达到修复受损的神经通路和突触连接，从而恢复瘫痪肢体的功能［1－2］。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)具备取材方便、扩增迅速、免疫原性低、能自体移植等优点，成功解决了胚胎干细胞、神经干细胞等种子细胞移植可能遇到的来源以及伦理等诸多问题，成为细胞移植治疗脊髓损伤最具潜力的种子细胞。本实验采用不同的细胞生长因子对hUCMSCs进行诱导培养，2周后原子力显微镜观察细胞表面超微结构变化，荧光定量PCR检测细胞诱导后神经元标志物神经丝蛋白H(neurofilament protein H，NEFH)、胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和巢蛋白(nestin)mRNA的表达情况，直接证实诱导后的细胞具有神经元的部分功能(称之为类神经元)。目的在于探索一种有效的诱导方法，为hUCMSCs移植治疗急性脊髓损伤提供合理的方法和客观的依据。

材料和方法

1 材料

DMEM/F12培养基和胎牛血清购自Gibco;Ⅱ型胶原酶、碘化丙啶(propidium iodide，PI)和丁基羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)购自上海生工;碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和脑源性神经营养因子(brain－derived neurotrophic factor，BDNF)购自Sigma;M－MLV、RNase、Random primer和RNase inhibitor购自TaKa－Ra;Trizol购自Invitrogen。

2 实验方法

2.1 hUCMSCs的分离和原代细胞的培养经暨南大学附属第一医院伦理委员会批准、产妇知情同意后取足月剖宫产脐带10～15 cm，无菌条件下放入盛有PBS溶液的广口瓶中，4℃冰箱保存。超净台紫外线照射30分钟后，取出脐带，用含1%青、链霉素(双抗)的PBS液反复冲洗后去除脐动静脉及脐带外膜，用眼科剪将脐带剪碎至约1 mm×1 mm×1 mm的小块。将组织块转移至50 mL离心管中，加入适量0.1%Ⅱ型胶原酶，采用酶消化法分离、提取所需细胞。台盼兰(0.4%)常温染色3 min后，倒置光学显微镜下观察细胞，调整细胞浓度以1×1010/m2的密度种植于25 cm2细胞培养瓶，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。48 h后半量换液，72 h后全量换液，以后每3～4 d换液1次，直至细胞基本铺满瓶底后再传代培养。

2.2 定向诱导hUCMSCs向类神经元分化取第5代(P5)细胞调整细胞密度，种1×105个细胞至25 cm2细胞培养瓶，随机分成A、B、C、D 4组，待细胞贴壁后使用诱导液培养，每3天换液1次。其中A组使用含有10 μg/L bFGF的DMEM/F12培养，B组用含有250 μg/L BDNF和10 μg/L bFGF的DMEM/ F12培养，C组用0.1 mmol/L BHA、250 μg/L BDNF和10 μg/L bFGF的DMEM/F12培养，D组为空白对照组，使用DMEM/F12基础培养基。

2.3 检测方法

2.3.1 流式细胞术检测hUCMSCs表面抗原

0.125 %胰蛋白酶消化P3细胞，加入PBS离心后去掉胰蛋白酶，调整细胞浓度达1×109/L以上。将待检细胞样品分装后阴性对照管加入鼠IgG－FITC、IgGPE，其它管分别加入鼠抗人CD105－FITC、CD29－PE、CD45－FITC、CD44－FITC、HLA－DR－PE和CD34－PE，各20 uL，室温孵育30min后，流式细胞仪检测。

2.3.2 细胞诱导培养2周后原子力显微镜观察细胞表面超微结构取P5细胞，消化后加入适量培养基稀释，调整细胞个数为1×105，种植于6孔板的无菌盖玻片上，待细胞贴壁生长后培养2 d，使用多聚甲醛固定后原子力显微镜观察细胞形态。

2.3.3 实时荧光定量PCR检测nestin、GFAP和NEFH细胞诱导培养2周后收集细胞沉淀，采用Trizol溶液提取RNA，具体操作按照Invitrogen Trizol使用说明书。在RNase free的PCR管中取1 μg RNA用于逆转录，得到的cDNA加入1 μg用于PCR实验。扩增条件是:95°C 5 min;95°C 15 s，50°C 15 s，72°C 32 s，30个循环;72°C 7 min。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1.Primer sequences

3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件分析数据，计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较采用单因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 细胞形态学及生长特点

酶消化法培养24 h后倒置显微镜下观察可见有部分细胞贴壁，贴壁细胞形态不一大部分呈梭形、纺锤形，少部分呈多角形，细胞遮光性较差。原代培养5 d后贴壁细胞数量明显增多，开始出现细胞集落部分融合成片状，细胞变长，呈长而扁平的梭形类似于成纤维细胞形态，高倍镜下可见细胞周围呈现不规则突起。10 d后细胞基本铺满瓶底，集落呈漩涡状或辐射状，大部分细胞融合在一起，细胞间隙不清楚，细胞遮光性较好见，图1。

Figure 1.Human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUCMSCs)cultured for different time(×150).图1 原代培养的人脐带间充质干细胞

2 流式细胞术分析hUCMSCs的细胞表面分子表达特征及细胞周期

流式细胞术检测显示细胞大部分处于静止期(G0/G1期)，表明只要有少部分细胞处于增殖期即可大量增殖，显示出hUCMSCs强大的增殖能力。流式细胞术检测结果显示hUCMSCs高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞标志，说明我们分离培养得到的细胞是hUCMSCs而不是其它细胞;不表达CD34、CD45等造血细胞标志和人类白细胞抗原HLA－DR，说明其免疫原性低。

3 原子力显微镜观察细胞形态

细胞膜的超微结构在细胞间的信号传导、物质交换、支撑细胞和定向分化等方面具有关键的作用，故研究hUCMSCs定向诱导分化后细胞膜表面超微结构的变化具有极为重要的意义。诱导培养后14 d观察细胞核表面5 μm超微结构，具体情况如下:A组细胞呈星形，细胞表面可见数量不多的突起，细胞核表面颗粒的直径分布在50～150 nm，大小颗粒的数目较均匀;B组细胞呈神经元样改变，细胞周边可见大小不一的树突状结够，细胞核表面颗粒较大，直径在100～180 nm之间，直径为100 nm和150 nm的颗粒数目较多;C组细胞形态不规则，细胞核表面颗粒分布在150～350 nm，考虑为BHA对细胞的毒性作用导致细胞骨架重塑，细胞皱缩的结果;D组为空白对照组，细胞呈现典型的的长梭形，细胞核边界清楚，其表面颗粒小且较均匀，直径在40～60 nm之间，见图2。

4 荧光定量PCR检测结果

由总RNA逆转录合成的cDNA为标准进行扩增，结果显示GFAP在4个组内均未见表达，NEFH在A组和B组有表达，nestin在A、B、C组均有表达，但C组表达量极少。且B组NEFH及nestin的表达量明显高于其它组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

讨论

干细胞移植治疗SCI是近年来研究热点，hUCMSCs是一种理想的干细胞种子细胞。自从2002年Woodbury等［3］首次报道体外将骨髓MSCs诱导分化成神经元以来，经过国内外学者的不断探索目前体外诱导MSCs分化成神经元的诱导大致分为4类:抗氧化剂诱导、细胞因子诱导、中药诱导、MSCs和神经干细胞共培养。Woodbury等［3］将抗氧化剂2－巯基乙醇、二甲基亚砜加入BMSCs中，首次证明了骨髓MSCs诱导后逐渐向成熟神经元分化。程朝辉等［4］采用bFGF、EGF、NGF、GM和ATP组成的复合细胞因子诱导剂，诱导48 h后免疫组化检测nestin和NF呈阳性表达而GFAP呈阴性。Alexanian等［5］将小鼠源性的骨髓MSCs与神经干细胞以1∶1的比例混合后使用神经干细胞生长支持性培养基培养后可远观察到神经干细胞样细胞产生，且这些细胞阳性表达神经丝微管蛋白和胶质纤维酸性蛋白。项鹏等［6］和马廉等［7］采用含复方丹参注射液为诱导剂诱导UCMSCs，免疫细胞化学检测结果显示诱导后的细胞阳性表达巢蛋白、神经微管和神经微丝、神经胶质纤维酸性蛋白。以抗氧化剂为基础的诱导途径虽然能短时间内诱导干细胞转化，但其诱导剂大多具有毒性不能在临床实验中使用，Lu等［8］认为是因为细胞毒性损害、胞浆收缩、细胞骨架破坏导致细胞呈神经元样改变，Neuhuber等［9］认为诱导后出现的细胞突起是细胞骨架因子F－肌动蛋白裂解后重建的结果，而非真正的树突或轴突。细胞因子诱导途径与其它途径相比更加安全，是具有广阔前景的诱导方法。

Figure 2.The cell surface morphology detected by atomic force microscope(AFM)14 d after induction.A:the cell surface morphology of A group induced by 10 μg/L bFGF;B:the cell surface morphology of B group induced by 250 μg/L NGF and 10 μg/ L bFGF;C:the cell surface morphology of C group induced by 0.1 mmol/L BHA for 24 h followed by 250 μg/L NGF and 10 μg/L bFGF;D:the cell surface morphology of D group cultured only in DMEM/F12.图2 培养14 d后原子力显微镜的观察结果

Figure 3.The expression level of NEFH and nestin mRNA in hUCMSCs 14 d after induction.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs D group.图3 荧光定量PCR检测结果

bFGF是重要的神经营养因子，在体内能维持神经元、神经胶质细胞的存活，诱导神经元合成神经特异性基因产物以及乙酰胆碱转移酶，促进交感、副交感神经元轴突生长，在体外bFGF是具有广泛生物活性的肝素黏多肽，能促进细胞的黏附、增殖与分化，促进神经干细胞增殖并决定其横向分化，作用机制可能与其参加了MSCs向神经元分化的启动［10－11］，林丽等［12］证实bFGF可促进hUCMSCs增殖。本实验结果显示采用bFGF和BDNF 2种细胞因子能够有效诱导hUCMSCs分化成类神经元，NEFH和nestin表达阳性。NEFH及nestin是神经元的标志物，说明诱导后的细胞具有神经元的部分特征。仅采用bFGF也能够诱导hUCMSCs分化成类神经元，但是效率不高;采用bFGF、BDNF和BHA三者联合诱导方案几乎未能诱导hUCMSCs分化成类神经元。这说明bFGF可能是诱导必须的，而BDNF能够促进分化过程，BHA却抑制分化过程。关于bFGF和BDNF诱导MSCs向神经元分化的作用机制有待于进一步的深入研究，推测可能是这些细胞因子作为神经细胞生长、发育、分化的调节剂，形成了体内神经细胞发育所需的微环境从而促进细胞分化。Quirici等［13］认为MSCs表面存在着亲和力较低的神经生长因子受体，当细胞因子单独或者联合作用于MSCs时，可以与具有多向分化潜能的MSCs表面受体结合，进而激活复杂的胞内反应，从而促进MSCs向神经元样细胞分化。本实验的结果也显示出类似的结果。

总之，采用DMEM/F12培养基添加250 μg/L BDNF及10 μg/L bFGF能够诱导hUCMSCs分化成类神经元，为下一步对诱导机制的研究以及临床应用提供实验依据。

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Differentiation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord

ZHOU Zhi－gang，LI Zhi－zhong，LIN Yong－xin，SHAO Jian－li，JIAO Gen－long，SUN Guodong，ZHOU Xiao－bin，DING Zhi－yong

(Department of Orthopaedics，The First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510630，China，E-mail:lizhizhong1@medmail.com.cn)

AIM:To explore an ideal method to induce the differen－tiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUCMSCs)into neuron－like cells and to provide some evidence for the transplantation of hUCMSCs for spinal cord injury.METHODS:The hUCMSCs were isolated from human umbilical cord digested with collagenaseⅡ.The hUCMSCs was verified by flow cytometry analysis.The passage 5 cells were randomly divided into 4 groups.The differentiation of hUCMSCs was induced by bFGF in group A，bFGF and BDNF in group B，or BHA，bFGF and BDNF in group C，while the cells in group D served as a control group cultured with DMEM－F12 and 10%FBS.Two weeks later，the expression of nestin，neurofilament protein H(NEFH)and glial fibrillary acidic protein(GFAP)was detected by realtime PCR and immunocytochemistry.The morphological changes of cells were observed under an atomic force microscope.RESULTS:Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from human umbilical cord by enzyme digestion.hUCMSCs expressed CD29，CD44 and CD105，but no CD34，CD45 or HLA－DR.After cultured with inducing medium for 2 weeks，the cells were successfully induced into neuron－like cells.The appearance of the cells had great change.The induced hUCMSCs developed round cell bodies with multiple neurite－like extensions observed under an atomic force microscope.The result of real－time PCR showed that nestin was positive in A，B and C groups，and NEFH was positive in A and B groups，but GFAP was negative in 4 groups.The difference of nestin and NEFH expression among the induced groups was signifi－cant(P＜0.05).CONCLUSION:Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from human umbilical cord by enzyme digestion in vitro，and all the hUCMACs presented stable biological properties.Moreover，hUCMSCs were induced to differentiate into neuron－like cells in vitro via bFGF combined with BDNF.

Umbilical cord mesenchymal stem cells;Differentiation;Neuron－like cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.007

1000－4718(2015)02－229－05

2013－12－29

2014－11－28

广州市科技计划(No.12C32071662);广东省中医药局项目(No.2013113);暨南大学第一临床医学院科研培育

专项基金(No.2012103);暨南大学第一临床医学院科研培育专项基金(No.2013208)

△通讯作者Tel:020－38688617;E－mail:lizhizhong1@medmail.com.cn