谷氨酰胺对大鼠肠缺血再灌注损伤后闭合蛋白的保护作用*

王爱丽，牛琼，史宁，贾兴芳，刘成霞

(滨州医学院附属医院消化内科，山东 滨州 256603)

谷氨酰胺对大鼠肠缺血再灌注损伤后闭合蛋白的保护作用*

王爱丽，牛琼，史宁，贾兴芳，刘成霞△

(滨州医学院附属医院消化内科，山东 滨州 256603)

目的:探讨谷氨酰胺(Gln)对大鼠肠缺血再灌注损伤后闭合蛋白(occludin)的保护作用及其可能机制。方法:成年雄性Wistar大鼠30只随机分为假手术组(sham组)、缺血再灌注损伤组(I/R组)和谷氨酰胺预处理组(Gln组)。Gln组给予谷氨酰胺1 g·kg－1·d－1连续灌胃7 d。Sham组和I/R组以同等剂量生理盐水灌胃7 d。Sham组仅分离肠系膜上动脉而根部不夹闭。I/R组和Gln组均用无损伤血管夹夹闭SMA根部30 min后放松血管夹形成再灌注损伤模型。各组大鼠均于制模后24 h采集静脉血和回肠标本。酶联免疫吸附试验检测血清中肿瘤坏死因子(TNF)－α、白细胞介素(IL)－10和IL－2水平。全自动生化仪检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)水平。免疫组化及Western blotting法检测occludin蛋白的表达情况。结果:I/R组occludin蛋白表达明显低于正常对照组及谷氨酰胺处理组(P＜0.05);I/R组TNF－α和MDA水平均高于sham组和Gln组(P＜0.05)。I/R组血清的SOD活力、GSH、GSH－Px、IL－10和IL－2均低于sham组和Gln组(P＜0.05)。结论:谷氨酰胺对肠缺血再灌注损伤后的occludin蛋白具有保护作用，其机制可能与抑制炎症反应、抗氧化应激有关。

谷氨酰胺;肠缺血再灌注损伤;闭合蛋白;炎症;氧化应激

缺血再灌注损伤(ischemia－reperfusion injury，IR)是各种原因导致组织器官缺血时引起的细胞代谢障碍和组织结构破坏，当血供恢复时，组织及细胞损伤反而加重的现象［1］。小肠是缺血再灌注损伤最常累及的器官，在肠绞窄、小肠移植和肠系膜血管缺血性疾病等情况下，均会引起小肠的缺血性损伤［2］。肠道黏膜屏障是防止肠道内有害物质和病原体进人机体内环境，并维持机体内环境稳定的一道重要屏障，主要由机械屏障、免疫屏障、化学屏障和生物屏障4部分组成。其中，构成机械屏障的紧密连接起到主要作用［3－4］。肠I/R损伤与其它器官I/R的损伤不同，不仅有氧自由基生成、免疫细胞应答、炎症因子的释放等过程，还有缺血、缺氧导致内皮细胞和上皮细胞屏障功能被破坏，进而引起细菌发生移位，可引起全身性的免疫应答和多器官功能障碍［5］。谷氨酰胺(glutamine，Gln)是肠上皮细胞重要的营养物质，在氧化应激中对机体起到保护作用，也在肠道相关免疫系统中扮演重要角色，在肠道严重损伤的情况下可以不仅增加小肠吸收面积，还可以增加肠黏膜的细胞构成［6］。本课题组的研究表明［7－8］，Gln对体外缺氧再灌注损伤的肠上皮细胞具有保护作用，本研究拟利用大鼠建立肠缺血再灌注损伤模型，探讨Gln对大鼠肠缺血再灌注损伤后闭合蛋白(occludin)的保护作用及其可能作用机制。

材料和方法

1 药物和试剂

谷氨酰胺粉末，纯度99%，购自Sigma;兔抗大鼠occludin抗体购自Abcam;山羊抗兔IgG－HRP II抗、牛血清白蛋白购于南京碧波生物科技有限公司;βactin抗体购于北京博奥森生物技术有限公司;Western blotting上样缓冲液购于Fermentas;考马斯亮蓝蛋白浓度试剂盒、SOD、MDA、GSH及GSH－Px试剂盒购于南京建成有限公司;IL－2、TNF－α及IL－10 ELISA试剂盒购自厦门慧嘉生物有限公司。

2 实验动物

32只清洁级健康成年雄性Wistar大鼠，体重220～250 g，由山东大学实验动物中心提供，批号为SOXXK(鲁)20090001。

3 实验步骤

3.1 动物分组与处理动物随机分为假手术组(sham);I/R组:缺血再灌注损伤模型组;Gln组:模型+Gln 1 g·kg－1·d－1。每组10只。Gln组于造模前7 d开始给予1 g·kg－1·d－1谷氨酰胺连续灌胃，sham、I/R组分别于造模前给予同等剂量生理盐水灌胃。

3.2 动物模型复制所有大鼠术前禁食12 h，但可自由饮水，10%水合氯醛腹腔注射(3 mL/kg)麻醉。Sham组动物取腹正中切口，长约3.0 cm，用温盐水纱布将肠管推向左侧腹腔，暴露右肾内上方的肠系膜根部，找到肠系膜上动脉分离后不作阻断。I/R组则显露肠系膜上动脉，用无创血管夹阻断其系膜血管30 min，造成肠缺血模型，松夹再灌注24 h。Gln组显露肠系膜上动脉，其余操作同I/R组。操作过程中所有大鼠腹腔注入37℃生理盐水0.5 mL/kg以保持血流动力学稳定。实验结束后关腹。

3.3 标本取材与处理I/R再灌注24 h后再次麻醉剖腹，立即从腹主动脉采集血标本，行全血离心(4℃、3 000 r/min)。20 min后分装血清，－80℃冰箱保存备用。剪取距回盲部约10 cm处4.0 cm长回肠标本，迅速用冷生理盐水溶液冲洗，清除黏液、污物等肠腔内容物后，用滤纸吸干，立即投入装有10%甲醛溶液中固定，以备免疫组织化学等组织病理学检测。

3.4 免疫组化法检测肠组织occludin蛋白的表达情况标本置于4%多聚甲醛中固定，包埋切片。具体步骤如下:石蜡切片脱蜡至水;3%H2O2室温孵育5～10 min;加0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)，于微波炉内修复10 min;10%山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育15 min，倾去血清，滴加I抗工作液(1∶200稀释)，4℃过夜;滴加适量生物素标记II抗工作液，37℃孵育30 min;滴加适量的辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育15 min;显色剂显色3 min(DAB);自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。Motic Images Advanced 3.2图像分析系统采集图片。

3.5 Western blotting半定量测定occludin蛋白的含量取3 cm回肠标本，纵向剪开肠腔，生理盐水冲洗后，置于－80℃保存。将保存组织放入组织匀浆器内，每100 mg加1 mL全蛋白提取液(0.15 mol/L氯化钠+0.05 mol/L三羟甲基氨基甲烷+1.0%聚氧乙烯辛基苯基醚，每10 mL加全蛋白酶抑制剂混合片1片)研磨。12 000 r/min，4℃离心20 min，取上清液，测定总蛋白含量。分别取40 μg的总蛋白加入上样缓冲液，煮沸10 min后，先行聚丙烯酰胺凝胶电泳，后转移至PVDF膜上，加入5 g/L BSA室温封闭1 h，加入occludin和β－actin(1∶500)抗体，4℃孵育过夜，漂洗后加入IgG－HRP II抗(1∶3 000)，室温孵育1 h，漂洗、曝光成像。Quantity One软件分析测定结果，计算目标蛋白相对含量(目标蛋白灰度值/β－actin灰度值)。

3.6 IL－2、IL－10和TNF－α含量的测定采用ELISA法测定，实验步骤严格按照操作说明书进行。往血清样品中分别加人IL－2、IL－10和TNF－α特异性抗体，最后加入反应终止溶液，并在450 nm处测定A值。

3.7 血清SOD活性和MDA含量的检测采用硫代巴比妥酸法测定血清中MDA含量;采用黄嘌呤氧化酶法测SOD活性;采用二硫代二硝基甲苯胺法测定血中GSH含量及GSH－Px活性。测定所用试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。操作步骤严格按照说明书进行。仪器采用上海产721型分光光度计，测定对照管及测定管的吸光度值，通过公式计算求出被测样品的SOD、MDA、GSH及GSH－Px水平。

4 统计学处理

全部计量数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。数据进行正态性检验和方差齐性检验。对符合正态分布和方差齐性的资料进行单因素方差分析，组间比较采用LSD－t检验。输入SPSS 17.0统计软件处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 谷氨酰胺对肠缺血再灌注损伤血清中IL-10、IL-2和TNF-α的影响

I/R组血清中MDA、IL－10和TNF－α水平均高于假手术组和Gln组;IL－2、GSH、GSH－Px及SOD水平均低于假手术组和Gln组(P＜0.05);谷氨酰胺处理组与正常对照组各项指标比较，差异均无统计学意义，见表1、2。

表1 各组大鼠血清IL-2、IL-10及TNF-α的含量Table 1.Serum levels of IL－2，IL－10 and TNF－α in the rats with different treatments(ng/L.Mean±SD.n=10)

表2 各组大鼠血清SOD、MDA、GSH和GSH-Px的含量Table 2.The serum levels of SOD，MDA，GSH and GSH－Px in the rats with different treatments(Mean±SD.n=10)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs IR.

2 谷氨酰胺对肠缺血再灌注损伤后肠组织occludin蛋白的影响

根据免疫组织化学染色结果，正常对照组中occludin蛋白分布于小肠黏膜上皮细胞膜，表达呈强棕褐色信号;肠缺血再灌注损伤组occludin蛋白表达明显减弱，呈低表达;谷氨酰胺处理组可观察到occludin蛋白的棕褐色信号表达较损伤组高，但弱于正常对照组，见图1。

Figure 1.The protein expression of occludin determined by immunohistochemistry(×400).图1 各组肠黏膜occludin蛋白表达的免疫组化结果

3 Western blotting半定量测定occludin蛋白含量

肠缺血再灌注损伤组occludin蛋白的表达明显低于正常对照组(P＜0.05)，而谷氨酰胺预处理组occludin蛋白的表达高于肠缺血再灌注损伤组(P＜0.05)，谷氨酰胺处理组与正常对照组occludin蛋白的表达差异无统计学意义，见图2。

Figure 2.The protein levels of occludin by determined by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs sham;##P＜0.05 vs IR.图2 各组肠黏膜occludin蛋白表达的Western blotting结果

讨论

缺血再灌注损伤是创伤、严重感染及休克等疾病共同存在的病理生理过程。小肠是对缺血再灌注损伤最敏感的器官之一，在肠绞窄、小肠移植和肠系膜血管缺血性疾病等情况下，均会引起小肠的缺血性损伤，在组织恢复血供时，再灌注损伤会加重对小肠的损伤。同时，小肠是机体最大的细菌库，缺血再灌注损伤消化道，削弱小肠的生理屏障功能，肠道黏膜屏障功能损伤的主要病理改变是肠黏膜通透性增加，从而导致内毒素血症、肠内细菌移位，引起大量炎症因子的释放，诱导全身炎症反应综合症和多器官功能不全综合症的发生［1，3］。

近来人们对肠缺血再灌注损伤的机制有了更深入的认识，如黄嘌呤氧化酶和氧自由基［9－10］、促炎细胞介质的释放［11］等机制均参与肠缺血再灌注损伤。小肠绒毛富含活性氧簇相关的酶，缺血再灌注激活了腺嘌呤－次黄嘌呤代谢途径，使氧自由基的产生异常增加。生物膜主要由脂质、蛋白质和糖类组成，脂质以磷脂为主，磷脂的主要成分是多聚不饱和脂肪酸，其中有多个弱键和不饱和键，氧自由基对其有很高的亲和力，过多的氧自由基可激发链式脂质过氧化反应，造成细胞膜性结构中脂类过氧化，抑制线粒体酶活性，使细胞膜、溶酶体膜通透性增加，导致细胞膨胀破裂，破坏肠黏膜结构和功能，导致肠黏膜通透性增高。当此反应链遇到谷胱甘肽、维生素E和维生素C等抗氧化物时就会终止。MDA是肠缺血再灌注损伤病理过程中一种代表性脂质过氧化物，其含量可直接反映机体内脂质过氧化的程度。SOD是体内清除氧自由基的最主要物质，其活力的高低反映了机体清除氧自由基的能力。同时，在肠缺血再灌注损伤过程中可引起补体活化，触发TNF－α从缺血肠黏膜释放，所分泌的TNF－α进一步刺激促炎细胞因子，如IL－1β、IL－6、趋化因子、黏附分子从浸润的白细胞和内皮细胞中释放，引发细胞因子级联反应。促炎细胞因子，如TNF－α、IL－6和IL－1β，成为肠缺血再灌注损伤的的主要致病因子［11－13］。促炎细胞因子进一步促进炎症细胞黏附和浸润到肠黏膜，并导致毛细血管阻塞、血管活性物质及细胞毒性成分的释放，最终引起多器官功能障碍综合征［14］。炎症也是肠黏膜损伤修复的重要因素。IL－10是一种分子量相当于18～21 kD的细胞因子，属于Th辅助细胞2类因子Th2由各种淋巴细胞产生，在缺血再灌注损伤过程中，IL－10抑制活化的单核巨噬细胞合成多种细胞因子(IL－1、TNF－α、IL－6、GM－CSF及IL－8)，调节中性粒细胞功能，诱导肥大细胞生长，在下调炎症反应中发挥关键作用［15］，是目前非常受关注的抗炎介质之一。

肠黏膜屏障是由机械屏障(包括肠上皮细胞和细胞间紧密连接)、化学屏障(各种消化液、各种消化酶、溶菌酶、黏多糖、糖蛋白、糖脂等)、微生物屏障(膜菌群、腔菌群)及免疫屏障［包括肠相关淋巴样组、M细胞、肠道免疫球蛋白(绝大部分是sIgA)及弥散免疫细胞］共同组成的组分，其中主要由occludin蛋白构成的紧密连接起到关键作用［3－4］。因此，occludin蛋白在维持细胞间连接、影响细胞活性、调节细胞旁通路通透性以及紧密连接信号调节等方面发挥着至关重要的作用，其功能状态对紧密连接以及上皮细胞的变化起到重要作用。Occludin蛋白的检测结果，在一定程度上可以反映出紧密连接和肠黏膜屏障的情况。

Gln是肠上皮细胞、淋巴细胞和巨噬细胞最重要和最易利用的能源燃料［16］，是抗氧化防御系统中重要物质谷胱甘肽和核苷酸等合成的前体。Wu等［17］的研究表明，Gln处理对肠缺血再灌注损伤肠黏膜具有保护作用，减轻缺血再灌注损伤。但是，Gln对肠黏膜的保护作用是否与抗氧化应激及抗炎症反应有关尚未明确。因此我们利用大鼠建立肠缺血再灌注损伤模型，探讨Gln对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。

本研究参照文献［18］的方法制备小鼠肠缺血再灌注损伤模型，通过免疫组织化学法发现，Gln处理组及正常对照组的occludin蛋白表达明显强于缺血组，Western blotting半定量结果也证实缺血组的occludin蛋白下调。同时，我们通过与正常对照组相比，缺血组血清的TNF－α水平显著增高，IL－10水平则显著降低，说明缺血再灌注可以激活机体的炎症反应。与缺血组比较，Gln预处理组血清的TNF－α水平则显著降低，而IL－10的含量则显著升高，说明谷氨酰胺可以通过抑制促炎因子(TNF－α)、促进抑炎因子(IL－10、IL－2)的产生来减弱炎症反应，减轻其带来的炎症损害。该作用机制可能与Gln可通过直接或间接地影响细胞内介质如cAMP、Ca2+的水平，以增加小肠细胞间紧密连接阻力、改变紧密连接对流动物质的选择性，降低乳糖跨紧密连接弥散率;通过限制产生细胞因子和多形核粒细胞浸润的炎症反应，减轻因其沿趋化梯度迁移引起小肠细胞间紧密连接阻力的降低。同时，与缺血再灌注损伤组相比，谷氨酰胺处理组的MDA水平显著降低，SOD活力、GSH及GSHPx含量显著升高，提示Gln可以抑制脂质过氧化反应，提高机体清除氧自由基的能力。由此可见，Gln处理可以减低缺血再灌注损伤，上调occludin蛋白的表达，该保护作用可能是通过抑制炎症反应、清除氧自由基，减轻脂质过氧化而起作用的。但Gln的使用方法、剂量以及协同效应等还需要进一步的探索研究，以彻底分析Gln对肠缺血再灌注损伤的作用机制，从而为临床工作提供指导。

［1］Guan Y，Worrell RT，Pritts TA，et al.Intestinal ischemia reperfusion injury:reversible and irreversible damage imaged in vivo［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2009，297(1):G187－G196.

［2］Acosta S.Epidemiology of mesenteric vascular disease: clinical implications［J］.Semin Vasc Surg，2010，23 (1):4－8.

［3］Furuse M，Hata M，Furuse K，et.al.Claudin－based tight junctions are crucial for the mammalian epidermal barrier: a lesson from claudin－1－deficient mice［J］.J Cell Sci，2002，156(6):1099－1111.

［4］Schneeberger EE，Lynch RD.The tight junction:a multifunctional complex［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2004，286(6):C1213－C1228.

［5］叶志强，戴海涛，卫洪波.乳果糖预处理减轻大鼠肠缺血再灌注损伤的机制研究［J］.中国病理生理杂志，2013，29(5):918－922.

［6］Demirkan A，Savasx B，Melli M.Endotoxin level in ischemia－reperfusion injury in rats:effect of glutamine pretreatment on endotoxin levels and gut morphology［J］.Nutrition，2010，26(1):106－111.

［7］潘璠，刘成霞.谷氨酰胺对体外肠上皮细胞缺血再灌注损伤后occludin蛋白表达的影响［J］.中华临床医师杂志:电子版，2012，6(10):2624－2627.

［8］王爱丽，牛琼，刘成霞，等.谷氨酰胺对大鼠肠缺血再灌注损伤的作用［J］.中国病理生理杂志，2014，30 (9):1703－1707.

［9］Ozkan OV，Yuzbasioglu MF，Ciralik H，et al.Resveratrol，a natural antioxidant，attenuates intestinal ischemia/ reperfusion injury in rats［J］.Tohoku J Exp Med，2009，218(3):251－258.

［10］Juránek I，Bezek S.Controversy of free radical hypothesis: reactive oxygen species－－cause or consequence of tissue injury?［J］.Gen Physiol Biophys，2005，24(3): 263－278.

［11］Yasuhara M.L－glutamine－induced heme oxygenase－1 protects small intestine from warm ischemia and reperfusion injury in the rat［J］.Hokkaido Igaku Zasshi，2001，76 (1):21－34.

［12］Fukatsu K，Lundberg AH，Kudsk KA，et al.Modulation of organ ICAM－1 expression during IV－TPN with glutamine and bombesin［J］.Shock，2001，15(1):24－28.

［13］Ahn J，Kim J.Mechanisms and consequences of inflammatory signaling in the myocardium［J］.Curr Hypertens Rep，2012，14(6):510－516.

［14］Liu X，Shen J，Jin Y，et al.Recombinant human erythropoietin(rhEPO)preconditioning on nuclear factor－kappa B(NF－κB)activation＆proinflammatory cytokines induced by myocardial ischaemia－reperfusion［J］.Indian J Med Res，2006，124(3):343－354.

［15］Frangogiannis NG，Mendoza LH，Lindsey ML，et al.IL－10 is induced in the reperfused myocardium and may moduiate the reaction to injury［J］.J Immunol，2000，165 (5):2798－2808.

［16］Oliveira GP，Oliveira MB，Santos RS，et al.Intravenous glutamine decreases lung and distal organ injury in an experimental model of abdominal sepsis［J］.Crit Care，2009，13(3):R74.

［17］Wu GH，Wang H，Zhang YW，et al.Glutamine supplemented parenteral nutrition prevents intestinal ischemiareperfusion injury in rats［J］.World J Gastroenterol，2004，10(17):2592－2594.

［18］Kazantzidou D，Tsalis K，Vasiliadis K，et al.Alanine－glutamine dipeptide pretreatment protects rat renal function from small intestine ischemia－repedusion injury［J］.Minerva Chir，2010，65(5):515－525.

Protective effects of glutamine pretreatment on occludin protein in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury

WANG Ai－li，NIU Qiong，SHI Ning，JIA Xing－fang，LIU Cheng－xia

(Department of Gastroenterology，The Hospital Affiliated to Binzhou Medical University，Binzhou 256603，China.E-mail: phdlcx@163.com)

AIM:To determine the effects of glutamine(Gln)pretreatment on occludin protein in the rats with intestinal ischemia－reperfusion(I/R)injury.METHODS:Male Wistar rats(n=30)were randomly divided into 3 groups(n=10):sham group，I/R group and Gln pretreatment group.The rats in Gln pretreatment group were pretreated with Gln at dose of 1 g·kg－1·d－1by orogastric route for 7 d，and those in the other 2 groups were pretreated with the same volume of normal saline.Intestinal I/R was induced by 30－min occlusion of the superior mesenteric artery followed by 24 h of reperfusion.After the operation，the levels of IL－10，IL－2，TNF－α，SOD and MDA were measured.The occludin protein was determined by the methods of immunohistochemistry and Western blotting.RESULTS:The occludin protein level in I/R group was significantly lower than that in sham group and Gln group(P＜0.05).The levels of MDA and TNF－α in I/R group were significantly higher than those in sham group and Gln group(P＜0.05).The levels of SOD，IL－10 and IL－2 in I/R group were significantly lower than those in sham group and Gln group(P＜0.05).CONCLUSION:Glutamine has a protective effect on occludin protein in intestinal ischemia－reperfusion injury.The mechanism may be related to oxidative stress response and inflammatory inhibition.

Glutamine;Intestinal ischemia－reperfusion injury;Occludin;Inflammation;Oxidative stress

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.031

1000－4718(2015)02－364－05

2014－07－20

2014－12－03

山东省自然科学基金资助项目(No.ZR2010HL051)

△通讯作者Tel:0543－3256725;E－mail:phdlcx@163.com