脂多糖结合蛋白在脓毒症患者诊断和预后预测中的作用

2015-05-16杨明施肖献忠湖南师范大学医学院生物化学与分子生物学教研室湖南长沙40006中南大学湘雅医学院病理生理学教研室湘雅三医院急危重症医学中心湖南长沙400

中国病理生理杂志 2015年7期

焦　京，蒋　宇，高　敏，王　念，杨明施，肖献忠△(湖南师范大学医学院生物化学与分子生物学教研室，湖南长沙40006;中南大学湘雅医学院病理生理学教研室，湘雅三医院急危重症医学中心，湖南长沙400)

焦京1，蒋宇2，高敏3，王念2，杨明施3，肖献忠2△
(1湖南师范大学医学院生物化学与分子生物学教研室，湖南长沙410006;
中南大学2湘雅医学院病理生理学教研室，3湘雅三医院急危重症医学中心，湖南长沙410013)

［摘要］目的:探讨脂多糖结合蛋白( LBP)在脓毒症患者诊断和预后预测中的作用。方法:挑选ICU的患者共80名，患者分为全身炎症反应综合征( SIRS)组(阴性对照组)、脓毒症存活组和脓毒症死亡组;所有患者均于进入ICU后24 h内采集血清样本并进行APACHEⅡ评分分析;另挑选10名健康志愿者血清作为正常对照组; ELISA检测各组样本血清LBP、C反应蛋白( CRP)和降钙素原( PCT)浓度;并以APACHEⅡ评分、血清LBP、CRP和PCT浓度对脓毒症诊断和预后预测做ROC曲线，评价LBP在脓毒症患者诊断和预后预测中的作用。结果:与SIRS组相比，脓毒症组的APACHEⅡ评分、血清LBP、CRP、PCT浓度均升高( P＜0. 05) ;与脓毒症存活组相比，死亡组的APACHEⅡ评分和血清LBP浓度升高( P＜0. 05)，而血清CRP和PCT浓度在脓毒症存活组与死亡组之间的差异无统计学意义; LBP血清浓度高于26. 84 mg/L时诊断脓毒症的敏感性和特异性分别为97. 1%和95. 9% ; LBP血清浓度高于54. 16 mg/L时预测脓毒症预后的敏感性和特异性分别为85. 2%和80. 0%。结论:与传统的脓毒症生物标志物CRP、PCT相比，LBP在脓毒症的诊断和预测方面都具有更好的效果。

［关键词］脓毒症;脂多糖结合蛋白; APACHEⅡ评分; C反应蛋白;降钙素原

脓毒症是指由感染因素作用于机体而引发的全身炎症反应综合征( systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，是重症监护病房( intensive care unit，ICU)常见的死亡原因之一，常在严重创伤、烧伤、多发伤、休克及大手术后发生［1］。脓毒症发病机制非常复杂且尚未完全阐明，病情进展凶猛迅速，给临床诊断和治疗工作带来极大困难。寻找对脓毒症早期诊断、预后预测有效的新方法和生物标志物对指导脓毒症的防治、降低其死亡率至关重要［2］。脂多糖结合蛋白( lipopolysaccharide binding protein，LBP)作为一种存在于正常人和动物血清中的糖蛋白，可与脂多糖( lipopolysaccharide，LPS)的类脂A成分结合，催化LPS结合CD14，刺激单核细胞、内皮细胞等释放白细胞介素1( interleukin-1，IL-1)、白细胞介素6 ( interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子( tumor necrosis factor，TNF)等炎性介质。当机体发生细菌感染时，血清LBP浓度会迅速升高，引发大量炎性介质分泌，造成机体损害［3-5］。因此，LBP是可能用于大鼠脓毒症诊断和预后预测的一个潜在生物标志物。本研究将挑选合适的脓毒症病人，探讨LBP在脓毒症病人的诊断和预后预测中的意义，并将其与传统的脓毒症生物标志物C反应蛋白( C-reactive protein，CRP)、降钙素原( procalcitonin，PCT)相比，评估其作为脓毒症生物标志物的临床实用价值。

材料和方法

1病人分组

选择2012年11月～2014年6月入住中南大学附属湘雅三医院ICU的患者共80名。入选的病人分为SIRS组( 20例)和脓毒症组( 60例)，其诊断依据为2001年国际脓毒症定义会议确定的关于脓毒症诊断的新标准［6］。

1.1SIRS组伴有下列临床表现中的2项或2项以上: ( 1)体温＞38. 3℃或＜36℃; ( 2)白细胞计数＞1. 2×1010/L或＜4×109/L或有10%以上的未成熟细胞; ( 3)脉搏＞90 min－1; ( 4)呼吸次数＞20 min－1或PaCO2＜32 mmHg。

1.2脓毒症组病人有已证明或疑似的感染，同时含有下列某些征象: ( 1)发热(中心体温＞38. 3℃) ; ( 2)低温(中心体温＜36℃) ; ( 3)心率＞90 min－1或大于不同年龄的正常心率的2个标准差; ( 4)气促＞30 min－1; ( 5)意识状态改变; ( 6)明显水肿或液体正平衡＞20 mL/kg超过24 h; ( 7)高糖血症(血糖＞110 mg/dL或7. 7 mmol/L)而无糖尿病史。

排除下列病人: ( 1)中性粒细胞减少(计数＜500/mm3) ; ( 2)人类免疫缺陷病毒感染(血清HIV抗体阳性) ; ( 3)口服糖皮质激素类药物超过1个月。

入选脓毒症组的患者追踪其病情转归，并根据其28 d结局分为存活组( 40例)和死亡组( 20例)。

1.3正常对照( control)组另取10名健康志愿者作为正常对照组。

2主要试剂

一次性真空采血管购自嘉兴华越医疗器械有限公司，LBP、CRP、PCT的ELISA试剂盒均购自武汉优尔生科技股份有限公司。

3主要方法

3.1临床资料分析3组患者( SIRS组、脓毒症存活组和脓毒症死亡组)均常规监测体温、呼吸、平均动脉压、心电图等，并于进入ICU后24 h内进行急性生理功能和慢性健康状况评分( acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ)。患者的临床基本资料见表1。

3.2血清样本的收集3组患者均于入ICU第1天采集血标本。全血置于室温下自然凝集20～30 min，轻轻地用木棉棒沿着试管壁分离血凝块，然后密封试管，以2 000～3 000 r/min的速度离心10 min，用毛细移液管将血清移出至EP管中，EP管标记好日期、采集时间、病人名称和病历号，放于－80℃低温冰箱保存。

3.3PBS缓冲液的配制准确称量KCl 0. 2 g，KH2PO40. 2 g，NaCl 8. 0 g，Na2HPO4·2H2O 1. 56 g。在容量瓶中将各成分依次溶解于1 000 mL的3蒸水中(注意应待前一种试剂完全溶解后再溶解下一种成分)，充分混匀，调节pH至7. 4。高压锅中121℃，消毒20 min。

3.4ELISA血清样本按照ELISA试剂盒说明书用PBS缓冲液进行稀释。设标准孔8孔，依次加入100 μL不同浓度的标准品。剩下的88孔加入待测样品100 μL，酶标板加上覆膜，37℃孵育2 h后弃去液体，甩干。酶标板上每孔加入检测溶液A工作液100 μL(按照ELISA试剂盒说明书于临用前配制)，37℃孵育1 h后弃去孔内液体。每孔用350 μL的洗涤液洗涤，重复洗板3次。最后一次洗板后，把孔内洗涤液完全甩干。每孔加入检测溶液B工作液100 μL(按照ELISA试剂盒说明书于临用前配制)，37℃孵育30 min后弃去孔内液体，每孔用350 μL的洗涤液重复洗板5次。每孔加入底物溶液90 μL，37℃避光显色20 min后，每孔加入终止溶液50 μL，终止反应。经酶标仪在450 nm波长测定各孔的吸光度( A)值。

4统计学处理

用SPSS 16. 0统计软件进行分析。所有实验数据均采用均数±标准差( mean±SD)表示，4组间比较用单因素方差分析，2组间的比较用LSD-t检验。以真阳性率(敏感性)为纵坐标，假阳性率( 1－特异性)为横坐标绘制ROC曲线。以P＜0. 05为差异有统计学意义。

结果

1临床资料分析

患者的临床基本资料见表1。3组患者在性别、年龄方面无统计学差异，但是平均动脉压、APACHEⅡ有统计学差异( P＜0. 05)。脓毒症患者多为革兰氏阴性菌感染，如鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌，仅有3名患者的血培养发现革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)。

2患者APACHEⅡ评分分析和血清LBP、CRP和PCT浓度

如图1所示，与SIRS组相比，脓毒症组的APACHEⅡ评分、血清LBP、CRP和PCT浓度均升高( P＜0. 05)，而与脓毒症存活组相比，死亡组的APACHEⅡ评分和血清LBP浓度升高( P＜0. 05)，而血清CRP和PCT浓度在脓毒症存活组与死亡组之间的差异无统计学意义( P＞0. 05)。

表1　患者临床资料统计Table 1.Clinical variables and demographics ( Mean±SD)

3APACHEⅡ评分和血清LBP、CRP和PCT浓度对脓毒症诊断的ROC曲线分析

各指标的ROC曲线下面积LBP为0. 996，APACHE II为0. 772，PCT为0. 937，CRP为0. 782，见图2、表2。LBP血清浓度诊断脓毒症的敏感性和特异性均最高，其浓度高于26. 84 mg/L时诊断脓毒症的敏感性和特异性分别为97. 1%和95. 9%。然后，我们用这一水平对另30位患者( SIRS组11例，脓毒症组19例)是否发生脓毒症进行判断，结果显示仅有2名患者判断错误，其余28位患者全部判断正确。LBP血清浓度高于26. 84 mg/L时诊断脓毒症的准确度高达92. 8%，见表3。

4APACHEⅡ评分和血清LBP、CRP和PCT浓度对脓毒症预后预测的ROC曲线分析

各指标的ROC曲线下面积LBP为0. 828，APACHE II为0. 897，PCT为0. 608，CRP为0. 682，见图3、表4。LBP血清浓度预测脓毒症预后的敏感性和特异性略低于APACHEⅡ评分，其浓度高于54. 16 mg/L时预测脓毒症预后的敏感性和特异性分别为85. 2%和80. 0%。然后，我们用这一水平对另18位脓毒症患者(存活组12例，死亡组6例)的结局进行预测，结果显示仅有2名患者判断错误，其余16位患者全部判断正确。如表5所示，LBP血清浓度高于54. 16 mg/L时对脓毒症患者结局预测的准确度高达87. 5%。

5APACHEⅡ评分和LBP相关性分析

APACHEⅡ评分和血清LBP浓度呈正相关( P＜0. 05)，见图4。

Figure 1.APACHE II score and concentrations of LBP，PCT and CRP of the first day.Mean±SD.n =20～40.*P＜0. 05 vs SIRS;#P＜0. 05 vs survivors.图1　各组APACHE II评分、血清中LBP、PCT和CRP的浓度

Figure 2.ROC analysis for serum concentrations of LBP，CRP，PCT and APACHE II score at the first day of admission for diagnosis in the patients with sepsis.图2　APACHE II评分、LBP、PCT和CRP诊断脓毒症的ROC曲线分析

表2　APACHE II评分、LBP、PCT和CRP诊断脓毒症的ROC曲线下面积及95%的可信区间Table 2.The ROC curve area of LBP，CRP，PCT and APACHE II scores and the 95% confidence interval for diagnosis of sepsis

表3　LBP浓度诊断脓毒症的可靠性分析Table 3.Reliability of LBP in diagnosis of sepsis in patients

讨论

脓毒症病情进展凶猛迅速，极易演变为脓毒性休克和多器官功能不全综合征，是重症监护病房主要的死亡原因之一［7］。治疗和预防脓毒症最有效的方法应是以脓毒症的发病机制为基础，但脓毒症涉及机体多个系统的广泛激活［8］，发病机制十分复杂，至今仍未完全阐明，这直接导致了对其诊断、预测和治疗上的不确定性。目前，重症监护医生常使用白细胞计数、CRP、红细胞沉降率和PCT来帮助诊断脓毒症并预测其预后［9］，然而它们却因敏感度和特异性不高而备受质疑。如果能找到一些敏感性和特异性更高的生物标志物，帮助医生诊断脓毒症、预测其发生、发展及结局，对于及时采取针对性措施以减轻病情、降低病死率无疑具有重要意义。

LBP是由肝脏合成的一种糖蛋白，与LPS中的类脂A具有高度亲和性［10］。作为LPS载体蛋白，LBP能介导LPS与CD14的结合，刺激单核细胞、内皮细胞等释放炎性介质，引起全身炎性反应综合征、脓毒性休克、急性肺损伤甚至多器官功能障碍综合征［11］。Opal等［12］发现重症脓毒症和脓毒症休克患者血浆LBP浓度显著升高。Zeng等［13］也发现LBP能提示机体急性炎症反应。LBP在正常人血中水平较低(＜2 mg/L)，当有微生物感染、炎症发生时LBP被迅速诱导产生并大幅度( 200～800 mg/L)增加。因此，LBP水平可作为某些疾病早期诊断和预后预测的重要标志。不过，也有研究发现LBP仅能反映机体急性炎症反应，而不能作为判断疾病严重程度及预后的指标［14］。LBP在脓毒症中的意义报道不一可能与病人背景、入ICU前所做的治疗等不一有关。

Figure 3.ROC analysis for serum concentrations of LBP，CRP，PCT and APACHE II score at the first day of admission for prognosis prediction of the patients with sepsis.图3　APACHE II评分、LBP、PCT和CRP预测脓毒症患者预后的ROC曲线分析

表4　APACHE II评分、LBP、PCT和CRP预测脓毒症预后的ROC曲线下面积及95%的可信区间Table 4.The ROC curve area of LBP，CRP，PCT and APACHE II score and the 95% confidence interval for the prognosis prediction of sepsis.

表5　LBP浓度预测脓毒症预后的可靠性分析Table 5.Reliability of LBP in prognosis prediction of sepsis

Figure 4.The correlations between APACHEⅡscore and LBP.图4　APACHEⅡ评分和LBP的相关性分析

我们的研究显示，正常人血清中存在一定水平的LBP，但在患者血清中，LBP浓度显著升高。与SIRS组相比，脓毒症组的血清LBP水平升高;与脓毒症存活组相比，死亡组血清LBP水平进一步升高，提示LBP水平升高不仅可以反映感染的发生，而且其与脓毒症患者的预后相关。虽然LBP血清浓度预测脓毒症预后的ROC曲线下面积比APACHEⅡ评分略低，但其敏感性和特异性均超过了80. 0%。进一步分析血清LBP浓度与APACHEⅡ评分的相关性发现，两者呈正相关，提示LBP可作为反映疾病严重程度和预后预测的指标。当血清中LBP的浓度高于26. 84 mg/L时诊断脓毒症的敏感性和特异性均超过95. 0%，而血清LBP浓度高于54. 16 mg/L时预测脓毒症预后的敏感性和特异性均超过80.0%。为进一步验证实验的可靠性，我们另外随机挑选了一批患者，取其血清作为验证样本数据。结果显示，LBP血清浓度高于26. 84 mg/L时诊断脓毒症的准确度高达92. 8%，而其浓度高于54. 16 mg/L时对脓毒症患者结局预测的准确度高达87. 5%。

目前临床上常用的脓毒症生物标志物有CRP和PCT。CRP在临床上已经用了很多年了，但其特异性不高［15］。虽然PCT比CRP的特异性更好，但它仍不能较好地判断脓毒症的预后，因此其临床实用价值也一直受到质疑［16］。本研究也显示传统的脓毒症生物标志物PCT和CRP的血清水平在辅助诊断脓毒症中具有一定的作用，但是它们在预测脓毒症患者的预后方面则效果较差。虽然研究结果显示APACHEⅡ评分也有助于脓毒症的预后预测，但其诊断脓毒症的敏感性和特异性均远逊于LBP。

与传统的脓毒症生物标志物PCT和CRP相比，LBP在脓毒症的诊断和预测方面都具有更好的效果，其敏感性和特异性均更高。上述结果提示，LBP是脓毒症诊断和预后预测的一个新的、潜在的生物标志物，其临床应用价值有待进一步评估。

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·短篇论著·

Measurement of serum lipopolysaccharide binding protein for diagnosis and prognosis prediction in septic patients

JIAO Jing1，JIANG Yu2，GAO Min3，WANG Nian2，YANG Ming-shi3，XIAO Xianzhong2
(1Department of Biochemistry and Molecular Biology，Medical College，Hunan Normal University，Changsha 410006，China;2Department of Pathophysiology，Xiangya School of Medicine，3Department of Emergency and Critical Care Medicine，The Third Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410013，China.E-mail: xiaoxianzhong11@ sina.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the role of lipopolysaccharide binding protein ( LBP) for diagnosis and prognosis prediction in the septic patients.METHODS: A total number of 80 ICU patients were enrolled.The patients were divided into systemic inflammatory response syndrome ( SIRS) group and sepsis group，the patients in sepsis group were divided into non-survivor sub-group and survivor sub-group.We collected the serum samples and analyzed acute physiology and chronic health evaluation ( APACHE) II score on the first day of the patients hospitalized in ICU.In addition，we also selected 10 healthy volunteers and collected their serum samples.The serum concentrations of LBP，C-reactive protein ( CRP) and procalcitonin ( PCT) were measured by ELISA.ROC analysis of LBP，CRP，PCT and APACHE II score was conducted to discriminate among critically ill patients with sepsis and predict the prognosis of the patients with sepsis.RESULTS: The levels of the 4 indicators in the septic patients were higher than those in the patients of SIRS ( P＜0. 05).In addition，serum LBP and APACHE II score in the non-survivor sub-group were higher than those in the survivor sub-group ( P＜0. 05)，whereas no difference of the PCT and CRP levels between survivors and non-survivors with sepsis was observed.LBP levels greater than 26. 84 mg/L had 97. 1% sensitivity and 95. 9% specificity to discriminate between SIRS and sepsis.LBP levels greater than 54. 16 mg/L had 85. 2% sensitivity and 80. 0% specificity for prognosis of unfavorable outcome.CONCLUSION: LBP level was more accurately correlated with diagnosis or prognosis prediction than CRP or PCT in patients with sepsis.

［KEY WORDS］Sepsis; Lipopolysaccharide binding protein; APACHE II score; C-reactive protein; Procalcitonin

通讯作者△Tel: 0731-82355022; E-mail: xiaoxianzhong11@ sina.com

［收稿日期］2015-01-28［修回日期］2015-04-15