FoxO转录因子在骨骼肌稳态中的作用及运动训练调控

张 庆，丁树哲

(1.华东师范大学青少年健康评价与运动干预教育部重点实验室，上海 200241;2.华东师范大学体育与健康学院，上海 200241;3.里昂高师分子细胞生物学实验室，法国里昂 69364)

骨骼肌占人体体重的40% ～50%，是人体最大的器官。骨骼肌稳态对于机体完整性的维持起重要作用，肌肉稳态受损与许多疾病密切相关。骨骼肌对机体内外刺激具备强大的适应性，如环境因子(低氧)、营养干预、机体物理负荷、收缩活动。所有这些刺激诱导肌肉的能量代谢和肌肉量发生改变，特别是改变肌纤维组成或者肌肉蛋白合成和降解的平衡［1－2］。FoxO家族在进化上是高度保守的，并在许多细胞过程中发挥重要作用，如调节细胞周期相关基因表达［3］、DNA 损伤的修复［4］、抵抗氧化压力［5］、能量代谢，以及细胞凋亡［6］。FoxO在骨骼肌纤维分化、肌肉量、能量代谢中的作用显示了FoxO家族在维持骨骼肌稳态中的重要地位(图1)。同时，通过不同的运动训练方式对FoxO表达影响的研究表明，耐力运动能够有效促进FoxO的表达，FoxO家族在骨骼肌对耐力运动的适应中发挥作用;而抗阻运动抑制FoxO1表达，有效预防肌肉萎缩。这些研究对理解骨骼肌对运动适应的机理起到关键的作用。运动与机体健康密切相关，对FoxO与骨骼肌稳态、运动训练的进一步研究有助于防治多种代谢疾病、肌肉疾病，提高生命质量。鉴于近年来对FoxO转录因子在机体中生理生化功能的大量研究和FoxO转录因子显示出的重要作用，本文特将FoxO在骨骼肌稳态以及运动对其调节作用的研究进展做一综述。

图1 FoxO在骨骼肌稳态中的作用［7］

1 FoxO转录因子

FoxO蛋白包含由80～100个氨基酸形成的可与DNA结合的序列:叉头型序列。此序列由于其蛋白结构域的蝴蝶状外形，也被称为翼状螺旋［8］。除了DNA结合域，FoxO转录因子同时也具有一个核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)、一个核输出序列(nuclear export sequence，NEL)，以及一个位于它们C末端的转录激活结构域(此结构域包括一个螺旋序列LXXLL，L代表亮氨酸，X代表任意氨基酸)，FoxO的转录激活结构域对于FoxO转录活性的完全激活起着关键作用。FoxO家族包括4个成员，分别是FoxO1(也称为FKHR)、FoxO3(也称为FKHRL1)、FoxO4(也称为 AFX1)以及 FOXO6。除此之外发现的FoxO2是FoxO3的同源物，FoxO5是FoxO3在斑马鱼中的同源物。FoxO1、FoxO3和FoxO4在体内各组织中广泛分布，而FOXO6虽然在氧化型肌肉中也有表达［9］，但是主要存在于中枢神经系统中［10］3。

FoxO1在发育中的胚胎血管中大量表达，对血管的形成起着关键性的作用。基因敲除研究发现，FoxO1基因敲除的胚胎由于血管发育不全，在10.5 d死亡［11］3。而 FoxO3a-/-小鼠可以存活，但表现出血液疾病(轻微的补偿性贫血以及相关网状细胞过多)，葡萄糖摄取速率下降。此外，雌性FoxO3a-/-小鼠表现为由于卵泡发育异常导致的年龄相关的生育力下降。FoxO3敲除小鼠表现为MyoD转录下调，在成肌细胞中，MyoD是FoxO3直接的靶蛋白，在肌发生中起着关键的作用［12］。此外，FoxO3敲除小鼠出现心脏肌细胞肥大，调节钙调神经磷酸酶相互作用蛋白 1-外显子 4(modulatory calcineurin-interacting protein 1，exon 4 isoform，MCIP1.4)异构体表达增加，这些都表明FoxO3在横纹肌细胞生长中起作用。FoxO4a-/-小鼠也是可以存活的，与对照组差别很小，基本不能区分，组织学分析未见异常［11］3。有研究发现，FoxO4a-/-小鼠表现出肺泡恶性腺瘤和雌性小鼠脑垂体腺瘤［13］。FOXO6敲除小鼠也可存活，但出现客体记忆和环境记忆巩固受损［10］3，FOXO6在骨骼肌中的具体功能大部分还未知。

2 FoxO调节肌纤维分化

FoxO转录因子在骨骼肌中表达，它们的表达水平受到机体能量代谢的影响。饥饿以及糖皮质激素能够使得骨骼肌中的FoxO1和FoxO3a表达水平升高［14］3。骨骼肌在调节糖代谢中起重要作用。这些生理生化变化使人们推断FoxO转录因子在骨骼肌中应该起着一定的作用。

IGF-1通过PI3K/Akt在成肌细胞分化中发挥作用［15］。IGF1受体突变抑制IGF1信号导致肌肉发育不全［16］，而 IGF1 过表达导致肌纤维增大［17］。C2C12细胞中，在肌管分化、磷酸化时FoxO蛋白表达水平下降;而FoxO持续性过表达会抑制从肌原细胞到肌管的分化。相反，FoxO1显性负突变会部分解除由磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂渥曼青霉素wortmannin导致的C2C12分化抑制作用。内源性FoxO基因抑制会导致肌球蛋白表达增加。在P19畸形恶瘤细胞中，FoxO1显性负突变会促进肌原细胞的分化，而持续性的FoxO1表达会抑制肌原细胞分化。综合上述，FoxO在IGF1依赖型肌原细胞分化中发挥作用。

FoxO介导的肌肉萎缩出现I型(慢氧化型)肌纤维相关基因和蛋白(如肌钙蛋白I，肌红蛋白)表达减少，I型肌纤维减少，I型和II型肌纤维体积变小［11］3。PGC-1α 是 FoxO 的一个靶蛋白，最初是在体外作为过氧化物增殖激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR-γ)辅激活因子被发现［18］。PGC-1α 会受到运动诱导而明显增加［19］，促进肌纤维从酵解型转换为氧化型［20］。研究发现在肝脏HepG2细胞中，FoxO1蛋白通过与胰岛素反应序列(insulin response sequence，IRS)相互作用刺激PGC-1α的启动子活性［21］，但是目前在肌肉中尚未有类似发现。

在啮齿动物的肌肉中，PGC-1α电穿孔法通过降低MAFbx(Muscle atrophy F-box)/atrogin-1和MurF1(muscle-specific RING-finger protein 1)表达水平，降低了FoxO3的转录活性，减少了由去神经支配和禁食诱导的肌肉萎缩，同时许多糖酵解和氧化磷酸化相关基因水平提高［22］。PGC-1α或PGC-1β在小鼠肌肉中过表达减少了由神经支配诱导的肌肉萎缩，降低了MAFbx/atrogin-1和MuRF1表达，抑制了NF-κB的活性［23］。除了 PGC-1α之外，I型肌纤维基因表达也受到肌细胞增强因子2c(myocyte enhancer factor 2c，Mef2c)和钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶II(Ca2+/calmodulin-dependent kinase II，CaMKII)的调节，在FoxO1过表达的转基因小鼠中，Mef2c和CaMKII的蛋白水平明显下降［11］4。研究发现，FoxO1主要在快肌纤维中表达，过表达FoxO1会诱导快肌纤维的形成。钙调磷酸酶信号通路是调节慢肌纤维相关基因表达的主要信号通路，Yuan等人发现，FoxO1通过抑制钙调磷酸酶通路降低C2C12肌管的氧化活性［24］。FoxO1对不同的肌纤维种类产生不同的作用。在后肢去负荷条件下，FoxO的mRNA水平在比目鱼肌和跖肌中都出现上调，但是这一效应仅与比目鱼肌较低的氧化功能相关。在此研究中，比目鱼肌的I型肌纤维的比例下降，酵解型肌纤维的比例增加，而跖肌中并未出现这种变化，这些都显著表明慢肌比快肌更明显地受到FoxO1的影响［25］。

综合上述，研究表明FoxO转录因子是肌肉萎缩中I型肌纤维相关基因的负调节因子，会导致肌纤维类型由慢氧化型向快酵解型的转变。而在肌肉耗损中的FOXO6-PGC1-α调节环应当进一步进行研究，以期对FoxO在骨骼肌稳态中作用有新的发现。

3 FoxO调节肌肉量

骨骼肌是人体最大的器官，除了其首要的运动功能之外，骨骼肌在能量代谢中发挥重要的功能。骨骼肌占有机体30%的静息代谢量以及80%的机体葡萄糖摄取量［26］。骨骼肌的总量和体积受到多种因素影响，比如工作负荷量、机体活动，以及许多疾病，包括癌症、糖尿病、败血症、库欣综合征(又称皮质醇增多症或柯兴综合征)等［27］4。骨骼肌总量受到合成和分解过程动态平衡的影响。肌肉肥大与蛋白合成增加相关，而肌肉萎缩增加了蛋白的降解。肌肉萎缩表现为蛋白降解增加，特别是ATP依赖型泛素蛋白酶体通路激活。IGF-1/PI3K/Akt的活性降低会导致肌肉萎缩。

肌肉特异性泛素连接酶包括MAFbx/atrogin-1和 MuRF-1［27］4。饥饿状态下，在出现肌肉量减少之前，MAFbx/atrogin-1 和 MuRF-1 受到诱导激活［28］。任意敲除二者之一，都会减轻由去神经支配诱导的肌肉萎缩［29］。FoxO除了在肌肉分化中的作用以外，它还在肌纤维降解中发挥作用。体外培养的肌管在饥饿或者糖皮质激素作用下，IGF-1-PI3K-Akt信号通路下调，FoxO表达增加，促使出现肌肉萎缩。IGF-1或者PI3K或Akt过表达，能够拮抗MAFbx/atrogin-1和MuRF-1表达量增加，以及后续的肌肉萎缩［30－31］4。Stitt等人发现小鼠肌肉注射 IGF-1 能够抑制由去神经支配导致的MAFbx/atrogin-1和MuRF-1的增加，以及肌肉萎缩。体内和体外研究都表明，FoxO3过表达也会提高MAFbx/atrogin-1的启动子活性，而在骨骼肌中FoxO1的过表达会导致严重的肌肉萎缩［30，32］4。从根本上看，能够促进肌肉萎缩，促进FoxO表达的各种内外影响因素都会直接调节肌肉萎缩相关基因的表达。运动可以诱导肌肉肥大，Akt磷酸化水平提高，减少核内FoxO1。相反，无运动训练会诱导肌肉萎缩，导致Akt磷酸化水平降低，增加核内 FoxO1。尽管 MAFbx/atrogin-1和MuRF-1的水平与肌肉萎缩不相关，但与FoxO1的表达相关［33］4。另外，Lee等人证明，FoxO3a在细胞核中的增加与肌肉萎缩不相关，FoxO3a与MAFbx/atrogin-1 启动子结合［34］。

肌肉生长抑制素myostain是FoxO与肌肉量减少之间的又一联系因子［35］4。myostain主要在骨骼肌中表达，myostain敲除小鼠表现为肌肉量明显增加，而它的过表达会减少骨骼肌总量［36－37］。在C2C12肌管中持续性的表达FoxO1会增强myostain启动子活性，而myostain启动子上的FoxO结合位点突变会降低myostain的活性［35］5。在骨骼肌分解状态下，FoxO1通过结合诱导翻译抑制因子4E-BP1(4E-binding protein-1)的启动子，降低蛋白合成［32］5。线粒体功能紊乱，以及AMPK激活会导致肌肉萎缩［38］。

FoxO1和FoxO3依赖型线粒体自噬在肌肉耗损中起到重要作用。在 FoxO依赖型肌肉萎缩中，FoxO1在成熟的肌管中以DNA结合依赖的方式激活诱导细胞凋亡［39］5。在去除物理负荷以及去神经化支配条件下，通过诱导线粒体相关预细胞凋亡基因，以及DNA片段化发现，细胞凋亡与骨骼肌萎缩直接相关［40］。在肌肉萎缩中，细胞凋亡相关基因Bcl-2细胞死亡调节子(Bcl-2-interacting mediator of cell death，BIM)和促凋亡调节蛋白Bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BCL2/adenovirus E1B 19-kDa protein-interacting protein 3(BNIP3)受到FoxO1诱导，可以通过引发线粒体分裂促进细胞凋亡［39］5。此外，FoxO1和FoxO3通过泛素蛋白酶体通路和自噬溶酶体通路诱导肌肉萎缩。在肌肉萎缩中，FoxO转录因子特别是FoxO3与线粒体紊乱以及线粒体自噬相关。

4 FoxO与能量代谢

FoxO1在肌肉能量稳态调节中起重要作用。它是糖代谢的重要调节因子，在骨骼肌、肝脏、胰腺、脂肪组织及骨骼中发挥作用［41－43］。在禁食状态下，FoxO1通过减少碳水化合物的分解影响肌肉能量代谢［14］5。丙酮酸脱氢酶激酶 4(pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4)基因是调节血糖的关键因子，在骨骼肌无能量供应时，FoxO1可以结合与PDK4启动子促进PDK4的表达［14］5。丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)催化从丙酮酸到乙酰辅酶A(acetyl-CoA)的反应，高水平的PDK4会诱导降低PDH活性，导致碳水化合物作为能量底物利用率降低［44］。FoxO1介导的PDK4表达增加通过抑制丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex，PDC)导致葡萄糖和葡萄糖异生底物(乳酸，丙酮酸和丙氨酸)积累以及糖酵解通量下降［45］5。

FoxO1是重要的肌肉脂肪氧化调节因子，其表达水平与脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)表达相关，脂蛋白脂肪酶是在禁食或者运动条件下水解血浆甘油三酯为脂肪酸和甘油供肌细胞摄取的酶［46］。此外，FoxO1过表达会提高 C2C12中的 LPL表达水平［47］5。脂肪酸转位酶FAT/CD36是骨骼肌摄取脂肪酸的主要膜蛋白，FoxO1可以改变FAT/CD36的亚细胞定位［45］5。脂联素受体(adiponectin receptors，AdipR)传输促进肌肉中脂肪酸氧化和脂联素敏感性的信号，FoxO1可以调节脂联素受体的表达［48］。综合上述，FoxO1在许多应激条件下起到决定使用脂肪而不是葡萄糖作为能量底物的开关作用。

对FoxO3在能量限制条件下的线粒体代谢中作用的研究表明，在低葡萄糖条件下，肌管线粒体中FoxO3的累积是 AMPK依赖性的［49］。葡萄糖限制会在线粒体DNA调节区域(mitochondrial DNA-regulatory regions，mtDNA-RR)诱导形成多蛋白复合体，包括FoxO3，SIRT3(一种线粒体去乙酰化酶)以及线粒体RNA聚合酶。FoxO3与线粒体DNA的相互作用会影响线粒体转录。SIRT3介导FoxO3与mtDNA-RR以及线粒体编码核心或氧化磷酸化体系亚单位结合，继而促进线粒体呼吸。这些研究扩展了人们对FoxO蛋白在能量代谢关键细胞器—线粒体中作用的认识，也显示了代谢紊乱研究的广阔前景。

总的来说，在FoxO家族，FoxO1调节糖酵解和脂肪分解通量，是主要的能量代谢稳态调节因子，而FoxO3在线粒体代谢中的作用也逐渐显现，FoxO4和FOXO6在骨骼肌能量代谢中的作用还有待进一步研究。

5 FoxO与骨骼肌的运动适应

FoxO蛋白除了在肌肉萎缩中发挥作用之外，研究表明，FoxO1和FoxO3也与骨骼肌运动适应密切相关。不同的运动训练方式对FoxO的表达产生了不同的影响。

5.1 FoxO与耐力训练

目前的研究认为，耐力运动能够有效地促进FoxO的表达，FoxO家族在骨骼肌对耐力运动的适应中发挥作用。

研究发现7周龄的C57BL/6J在进行了6h的有氧跑台运动(跑台坡度10%，运动强度15 m/min，运动时间45 min，运动训练次数为8次，运动间隔时间5 min)之后2 h，FoxO1和FoxO3的mRNA水平提高3～5倍，而在运动后16 h后，FoxO1和 FoxO3的mRNA水平又恢复到初始静息状态;在运动后2 h和16 h，LPL的表达也出现与FoxO1和FoxO3相同的变化趋势［47］6。另外一项耐力运动研究发现，14名健康青年男性进行75 min的大强度功率自行车运动后3 h，FoxO1表达上调5.2倍，在运动后48 h恢复到正常水平，而PGC-1α、PDK4、PPARα等与骨骼肌线粒体生物发生反应，糖脂代谢相关的蛋白分别提高2.9，3.5和1.7倍，同时它们也是FoxO1的重要靶基因［50］。这些研究表明，有氧运动可以上调FoxO，这可能与耐力运动可以促进脂肪代谢有关，也为证明耐力运动不能促进骨骼肌蛋白质的合成提供了依据。而在一次马拉松运动后FoxO3基因水平也升高［51］。与此相一致，过度耐力训练后，相关自噬标记蛋白(如LC3bII，Atg12)，MuRF1的mRNA水平以及蛋白酶体β2亚基活性提高［52］。这些适应性变化也出现在中等强度的运动中［53－55］。

由此，由FoxO1和FoxO3调节的分解代谢通路可以在持续时间长的运动中提供氨基酸作为能量代谢底物替代物，优化在运动后恢复中的蛋白周转。在骨骼肌运动中，受损细胞组分的移除或者循环是必不可少的。机体内外刺激诱导相关基因表达，影响肌肉代谢，促进肌肉在功能和肌肉量上的适应性变化。

Goodman等人研究发现，总的以及磷酸化的FoxO1和FoxO3在肌肉对长期的物理负荷诱导下产生明显的肥大和重塑中表达上调［56］。而总FoxO的增加是mTOR激酶依赖型的。在小鼠中，He等人发现自噬过程在运动对骨骼肌产生的有益代谢中起作用［57］。BCL2磷酸化位点突变会限制环境刺激诱导的BCL2-beclin-1复合体分裂以及自噬激活，而具有此突变的小鼠在急性运动中表现出耐力下降，葡萄糖代谢变化。这些都表明FoxO转录因子在肌肉对耐力运动的适应中发挥重要作用。

5.2 FoxO与抗阻训练

研究发现，14名健康男性进行30 min的台阶运动试验(一条腿做离心运动，一条腿做向心运动，8周后再重复进行一次此实验)，运动后的腿部股四头肌的骨外侧肌中，向心运动FoxO1的mRNA水平上调约70%，MuRF-1上调约150%;离心运动MAFbx/atrogin-1的mRNA水平上调65%并在运动后一周内保持此水平［58］。对8名青年(23岁±2岁)和6名老年(85岁±1岁)健康女性的研究表明，安静状态下老年女性的FoxO3A和MuRF-1基因表达水平高于青年女性，而MAFbx/atrogin-1以及TNF-α在不同年龄组间没有明显差异。而在进行3组，每组10次，70%最大肌力的伸膝练习后4h，在骨外侧肌中检测发现，老年女性组MAFbx/atrogin-1基因表达上调2.5倍，年轻女性组没有显著变化，MuRF-1在两组中都出现显著上升，但是FoxO3A和TNF-α没有明显变化［59］。这表明MuRF-1在抗阻训练中蛋白质代谢和肌肉重塑中发挥重要作用，而安静状态下高水平的FoxO3A和MuRF-1以及抗阻运动后高水平的MAFbx/atrogin-1可能与肌肉减少症(sarcopenia)密切相关，这为将来防治肌肉减少症提供了新的重要靶位点。

对25名健康男性(36岁±4.9岁)分组进行力量训练和肌肉制动研究发现，8周的力量训练使得股四头肌肌肉肥大(增长10%)，而8周的肌肉制动使得股四头肌出现肌肉萎缩(减少5%)。力量训练组Akt，GSK-3β以及mTOR蛋白磷酸化水平升高，核内FoxO1蛋白水平下降。正相反，肌肉制动组出现Akt，GSK-3β蛋白磷酸化水平下降，核内 FoxO1蛋白水平升高。MAFbx/atrogin-1和MuRF1蛋白水平在肌肉肥大后升高，而在肌肉萎缩后下降［33］6。这些表明，在人体骨骼肌中，Akt及其下游信号通路GSK-3β，mTOR，FoxO1的调节与骨骼肌肥大和萎缩密切相关，抗阻运动能抑制FoxO1表达，有效预防肌肉萎缩。

未来对这些方面的进一步研究将对理解骨骼肌对运动适应的机理起到关键的作用。例如运动中FoxO与线粒体自噬的研究，以及线粒体网络重构的研究。运动与生命质量息息相关，也是防治肌肉萎缩、代谢紊乱的最好方式，这些研究方向对于战胜多种代谢、肌肉疾病是非常关键的。

6 小结

综合上述，目前的研究已经极大地扩展了对FoxO转录因子在骨骼肌中作用的认识。它们控制肌肉细胞生长、分化、凋亡，以及能量代谢，其中对能量代谢的调控是通过作为由使用葡萄糖作为能量代谢底物转换为使用脂肪的开关以及调节线粒体代谢来实现。FoxO调节蛋白降解，FoxO1与调节泛素蛋白酶体通路相关，而FoxO3同时在泛素蛋白酶体通路以及自噬通路上发挥作用。另外最近发现FoxO1和FoxO3通过激活E3连接酶Mul1参与线粒体自噬的调节。细胞稳态的维持以及骨骼肌对运动刺激的反应需要正常水平的FoxO1和FoxO3，它们的过度激活会导致许多疾病，如肌肉萎缩、线粒体紊乱，以及有害的肌纤维类型变化。正常的蛋白降解水平对于维持肌肉的稳态是必要的。不同的自噬激活水平会对机体产生有利的或者不利的影响。研究发现，在肌肉耗损状态下，自噬是有害的，而在运动时自噬对维持细胞稳态起着关键性的作用。以这些研究为基础，对这些转录因子特别是它们在线粒体稳态中的研究，有助于相关疾病治疗手段的研发。对于预防或减缓在许多特定生理、病理条件下(如肌肉制动、衰老、去神经支配、神经肌肉疾病、艾滋病、癌症、糖尿病)出现的肌肉耗损具有非常重要的意义。

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