五味子对冰乙酸性胃溃疡寒、热证大鼠模型IL-8、VEGF水平的影响

胡国洪 舒 晴 聂红海 徐海英

(1广州中医药大学附属清远医院/清远中医院病理科，广州，511500;2广州中医药大学附属清远医院/清远市中医院肛肠普外科，广州，511500;3广州中医药大学附属清远医院/清远市中医院病案统计室，广州，511500)

胃溃疡是临床常见的消化系统疾病，具有反复发作的特点，胃溃疡的发生主要是胃黏膜的损害因素与自身防御修复因素之间的失衡有关［1］，受到多种因子及其受体的调控。五味子是一种具有辛、甘、酸、苦、咸五种药性的果实，五味俱全、五行相生，能对人体五脏的心、肝、脾、肺、肾发挥平衡作用，兼具精、气、神三大补益的药材［2］。大量研究表明，具有五种药性的五味子能对人体五脏发挥积极作用，为了深入探讨五味子对于消化系统的平衡作用，了解中医方证相应理论应用于胃溃疡寒热证的治疗功效，本研究通过联合应用ELISA、PCR、免疫组化方法检测五味子对冰乙酸胃溃疡寒、热证大鼠模型IL-8、VEGF表达水平的影响。

1 材料及方法

1.1 实验动物及分组 成年雄性SD大鼠250～300 g 30只，购自上海伊莱克斯动物实验中心，随机分为五组:即正常对照组6只，模型组(冰乙酸涂抹模型组)6只，五假组(五味子+假手术)6只，五热酸组(五味子+热因素+乙酸涂抹)6只、五寒酸组(五味子+寒因素+乙酸涂抹)6只。

1.2 实验用药 热因素:先将辣椒粉过120目筛，后溶入60%无水乙醇，配制成8%干辣椒粉的乙醇混悬液。寒因素:电子天平称取6 g氢氧化钠(NaOH)，溶入500 mL双蒸水配制成0.3 mol/L混合液。冰水:冷冻保存，使用时提前取出解冻。五味子药汤:购自西安新通制药有限公司(批号200806)，加8倍量沸水浸泡15 min，过滤;药渣再加入6倍量沸水浸泡15 min，过滤。将两次浸泡药液合并，浓缩成含生药0.15 g/L，冰箱存储备用。

1.3 试剂 100%冰乙酸(分析纯，天津市大茂化学试剂厂，20081211);VEGF试剂盒(美国RD公司，20081217);IL-8试剂盒(美国RD公司，20081217);医用酒精(黑龙江华润酒精有限公司，20091207);氢氧化钠(分析纯，天津市大茂化学试剂厂，20090712)1.4 仪器 恒温培养箱(SANYO，型号XD-101);酶标仪(BIO-RAD Model，型号550);低温离心机(科大创新股份有限公司，型号KDC-40)

1.5 造模方法［3-4］胃热模型:按10 mL/kg灌服8%干辣椒粉的乙醇混悬液，早晚各1次，连续7 d。胃寒模型:按10 mL/kg灌服冰水机0.3 mol/L NaOH溶液，早晚各1次，连续7 d。冰乙酸涂抹胃溃疡模型:禁食不禁水24 h，乙醚麻醉后剖腹，拉出全胃于胃底部，用自制胃夹将直接6 mm长2 cm的塑料管固定于上，然后向管内注入100%冰乙酸0.1 mL，与腺胃部前壁浆膜接触60 s后撤去胃夹，用生理盐水清洗局部，然后牵引大网膜包覆，缝合腹壁切口，常规消毒，纱布包扎。假手术:实验时将大鼠用乙醚麻醉，固定于木板上，开腹轻轻拉出全胃，用镊子或其他手术器械刺激腺胃部，将结扎线置于幽门部，但不结扎，缝合腹腔切口，用生理盐水清洗创口并消毒。五味子给药方式:造模术后24 h开始灌胃给药，按100 mg/kg每日1次灌胃。正常对照组、灌胃模型组喂予等容积的生理盐水，连续灌胃14 d。

1.6 实验取材 末次给药后24 h，颈动脉取血，分离血清，剖腹取胃，取适量胃组织，部分用于石蜡包埋用于免疫组化，部分生理盐水反复冲洗吸干，称取0.3～0.4 g研磨制成10%组织匀浆，离心后取上清液，-20℃冰箱保存，待测。

1.7 HE染色、免疫组化 标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，切成4μm厚的切片。苏木-伊红法进行HE染色。采用免疫组化SP法。即用型UltraSensitive-SP试剂盒，IL-8一抗工作浓度1∶100，VEGF一抗工作浓度1∶500。染色步骤参照说明书进行。二氨基联苯胺(DAB)显色，脱水，透明，封片。磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。溃疡面积的计算:用油标卡尺测量HE染片上溃疡的横径和纵径，计算溃疡面积(UA)，溃疡面积=×d1×d2×1/4(d1、d2分别为通过溃疡中心的最大横径和纵径)。免疫组化结果分析:IL-8、VEGF阳性表达判定以细胞胞浆出现棕黄色颗粒为表达阳性。每张切片在200倍光镜下拍10个视野，采用Motic image advanced 6.0软件对图像进行分析，以灰度值表示阳性细胞着色强度，以阳性着色面积占总面积百分比表示阳性密度。

1.8 ELISA测定血清IL-8及VEGF 按照试剂盒步骤进行。实验结果用EXCEL软件绘制标准曲线，以浓度为横坐标，以OD值为纵坐标，根据标准曲线公式，计算浓度。

1.9 RT-PCR 用RNA TRIzol试剂盒提取标本的RNA，按说明书操作。抽提RNA经过DNase(Promega)处理后，反转录酶PowerScriptTM Reverse transcriptase(Clontech)合成 cDNA.cDNA引物IL-8:5’ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGC3’(sense)和 5’ATGACTTCCAAGCTGGCCCGTGGC3’(antisense)［5］。扩增条件:94℃变性1 min;94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环;终止延伸72℃5 min。VEGF:5’AAGATCCGCAGACGTGTAAATGTT3’(sense)和5’CGGCTTGTCACATGCAAGTA3’(antisense)［6］.扩增条件:94 ℃变性1 min;94 ℃变性40 sec，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，40 个循环;终止延伸72℃5 min。所得结果用Motic image advanced 6.0软件对图像进行灰度分析实现对IL-8及VEGF的半定量检测。

1.10 统计学处理 使用SPSS 13.0软件，数据用(¯x±s)表示，用单因素方差分析(One-way ANOVA)LSD或S-N-K法进行两两比较检验，P＜0.05表示有统计学意义。采用Spearman等级相关分析溃疡面积和IL-8或者VEGF间的相关程度。

2 结果

2.1 HE结果显示五味子能够缩小胃溃疡面积 结果见图1、表1。

2.2 免疫组化结果及分析 免疫组化结果显示正常对照组及五假组胃组织中仅见极少量的IL-8阳性表达，而模型组中的IL-8阳性表达明显增多，而五味子灌胃治疗后，寒、热证胃溃疡大鼠胃内IL-8的阳性表达均有所减少(见图2)。免疫组化结果显示正常对照组及五假组胃组织中有少量VEGF阳性表达，而模型组中的VEGF阳性表达则增多，经过五味子灌胃治疗后，胃溃疡大鼠胃内VEGF的阳性表达均更加明显(见图3)对各组免疫组化结果图按前述的方法进行统计分析，见表2。

图3 各组胃部切片VEGF免疫组化结果比较

图1 各组胃部切片HE染色比较

表1 各组胃溃疡面积的比较(¯x±s)

表2 各组大鼠IL8、VEGF免疫组化结果分析

2.3 ELISA结果 模型组中的IL-8表达量显著高于正常组(P＜0.01)，而五味子能够下调乙酸涂抹胃溃疡寒热证模型的IL-8表达(P＜0.05)。模型组中VEGF的表达水平较正常组升高(P＜0.01)，而五味子灌胃治疗则进一步促进VEGF的表达(P＜0.01)。(表3)

表3 各组大鼠血清中IL-8及VEGF表达水平比较(¯x±s，pg/mL)

图2 各组胃部切片IL-8免疫组化结果比较

2.4 PCR定量结果 模型组中的IL-8 mRNA数显著高于正常组(P＜0.01)，而五味子治疗能够减少乙酸涂抹胃溃疡寒热证模型的IL-8mRNA的表达(P＜0.05)。模型组中VEGF mRNA的表达量较正常组增高(P＜0.01)，而五味子灌胃治疗则进一步促进VEGF的表达(P＜0.01)。见表4。

表4 各组大鼠血清中IL-8及VEGF RTPCR结果OD值比较(¯x±s)

3 讨论

胃溃疡是常见的消化系统疾病，是我国人群中的常见病、多发病之一。引起溃疡的常见病因主要有幽门螺杆菌感染、非甾体抗炎药(如阿司匹林)以及胃酸分泌异常［7］。研究表明，正常人胃黏膜的防御修复机制，足以平衡胃酸和胃蛋白酶的损伤作用，但当某些致病因素扰乱胃黏膜的平衡后，胃酸和胃蛋白酶侵蚀自身黏膜组织，从而形成胃溃疡［8］。五味子是一种具有辛、甘、酸、苦、咸五种药性的果实，含有丰富的有机酸、维生素、类黄酮、植物固醇以及有强效复原作用的木酚素，能够抑制胃酸分泌，抑制胃蛋白酶活性，从而减少胃酸和胃蛋白酶对胃黏膜的损伤作用;而从中医学的角度，胃溃疡寒热证致使胃气阴两伤，五味子性温且益气生津，这些均暗示着五味子用于治疗胃溃疡的可行性。此次研究证实了，应用五味子灌胃后，寒热证胃溃疡大鼠模型中的溃疡面积均有不同程度的减小(P＜0.05)，说明五味子能够对胃溃疡的形成起到抑制性作用。但是对于五味子的最佳用量、给药方式等还有待进一步探讨。

胃溃疡的一个特点是大量的炎性细胞浸润，这些炎性细胞之间通过释放炎性因子彼此之间构成复杂的炎性网络。IL-8在胃溃疡的致病机制中起到十分重要的作用，俄而抑制IL-8的表达无疑能够对炎性网络的蔓延起到抑制性作用。本次研究通过ELISA、PCR、免疫组化等多种手段对不同组血清或组织匀浆重的IL-8水平进行了检测，发现模型组中IL-8的表达对照正常组显著上升，这与之前的多数研究意一致，而通过五味子灌胃治疗，无论是在寒证还是热证胃溃疡胃溃疡模型中，IL-8的表达均收到抑制，并且相关性研究显示，五味子对胃溃疡面积的缩小作用与其对IL-8表达的抑制作用呈现良好的线性相关性，说明五味子对胃溃疡的抑制性作用很可能是通过其对IL-8的表达抑制实现。

VEGF属于内源性生长因子家族，能够刺激血管内皮细胞的有丝分裂，促进血管的形成，提高血管的通透性［10］。VEGF主要由主要由损伤处的角质细胞和巨噬细胞产生，能够保护胃黏膜和通过刺激腺体和血管生成促进溃疡愈合，其受体仅表达于血管内皮细胞表面。血管内皮生长因子在生理和病理条件下均有表达，但在病理条件下表达量增加。这与本次课题的研究结果一致，而通过五味子灌胃后，VEGF的表达量又进一步上升，VEGF的表达水平和溃疡处的血管生长情况呈正相关，可用于胃溃疡寒热证治疗效果的评价。五味子对胃溃疡面积的缩小作用与其对VEGF表达的促进作用呈现良好的线性相关性，更进一步证实了五味子对胃溃疡的积极疗效。

五味子能够改善冰乙酸性胃溃疡寒、热证大鼠模型胃溃疡黏膜面积，可能通过下调IL-8的表达，同时促进VEGF的表达有关。此次研究证实了五味子对冰乙酸胃溃疡寒热证的治疗功效。揭示五味子应用于消化系统的临床前景，以及中医方证相应的理论依据。然后，其具体的机制还有待进一步探讨和证实。

［1］王兆彬.106例消化性溃疡临床观察［J］.中国实用医药，2012，7(24):92-93.

［2］苏桂云，郭红星.五味子的炮制与功效［J］.首都医药，2012，19(11):44.

［3］才丽平，蒋宁，曲怡，等.胃粘膜表面局部投予乙酸制备大鼠胃溃疡模型的方法［J］.解剖科学进展，2011，17(1):8-11，15.

［4］李冀，柴剑波，李胜智，等.寒热方剂对幽门结扎型胃溃疡寒热证模型大鼠炎症因子含量的影响［J］.陕西中医，2011，32(11):1553-1555.

［5］Sharma SA，Tummuru MK，Miller gg，et al.Interleukin-8 response of gastric epithelial cell lines to Helicobacter pylori stimulation in vitro［J］.Infect Immun，1995，63(5):1681.

［6］李茜，韩曼丽，杨学文，等.实时荧光定量PCR检测大鼠 VEGF mRNA方法的建立及初步应用［J］.分子诊断与治疗杂志，2010(2):115-118.

［7］孟钰.复方嗜酸乳杆菌联合雷贝拉唑治疗消化性溃疡的疗效观察［J］.中国医药指南，2012，10(18):610-611.

［8］潘文，许丽娜.消化性溃疡296例三、四联疗法对比分析［J］.陕西医学杂志，2012，41(9):1253-1254.

［9］Fujiwara Y，Arakawa J，Fukuda T，et al.Interleukin-8 stimulates leukocyte migration across a monolayer of cultured rabbit gastric epithelial cells［J］.Dig Dis Sci，1997，42(6):1210.

［10］徐晶晶，黄萍，吴清和，等.胃疡宁丸抗实验性胃溃疡的药效及机制研究［J］.中国中药杂志，2013，38(5):736.