麻杏二三汤对哮喘大鼠肺组织TGF-β1和ET-1表达的影响

张 蕾 包天佑

(青海大学医学院，西宁，810001)

众所周知哮喘是一种反复发作的常见病，而气道重塑既是气道炎症反复刺激的结果［1］，又是哮喘向着不可逆发展的重要病理基础。地塞米松作为治疗哮喘炎症有效制剂，在延缓气道重塑方面也有一定作用［2］，但由于长期应用可以造成患者对此药敏感度降低以及服用西药本身的不良反应，故研制中药治疗哮喘迫在眉睫。麻杏二三汤作为焦树德大师的代表方剂在临床上治疗慢性哮喘急性发作有明显的作用［3］，本课题即是通过具体实验数据来探索麻杏二三汤对哮喘气道重塑的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 将50只健康SPF级雄性SD大鼠，体重(200±20)g(甘肃中医学院动物实验中心提供，合格证号:62001000000019，许可证号:SCXK(甘)2011-0001)在青海大学医学院动物房适应性喂养一周后进行随机分组:空白组(A组)、模型组(B组)、麻杏二三汤组(C组)、地塞米松组(D组)，每组共10只。

1.2 药物 麻杏二三汤(炙麻黄、杏仁、化橘红、半夏、茯苓、炒苏子、莱菔子、白芥子、诃子、甘草、枇杷叶、茉莉花茶，青海大学医学院中医门诊部)，使用前将一剂(总重100 g)文火煎煮后浓缩成1 g/mL。醋酸地塞米松片(天津d药药业股份有限公司)，研磨于水，浓度为1 mg/mL。

1.3 主要试剂与仪器 鸡卵清蛋白(OVA)(美国Sigma公司分装);氢氧化铝干粉(天津化学试剂三厂，分析纯);大鼠ELLSA转换生长因子-β1试剂盒、大鼠ELLSA内皮素-1试剂盒(北京科博信生物技术有限公司);透明不完全封闭染毒缸(直径40 cm，高45 cm);ZH-E11超声雾化器(江苏江航医疗设备有限公司);RT-6000酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)。

1.4 模型制备及药物干预 参照文献［4-6］并加以改良，制作哮喘大鼠早期气道重塑模型。除空白组外，实验开始的第1天、第8天、第15天将配好的致敏液1 mL(含有OVA 10 mg，氢氧化铝干粉200 mg)分多点注射于其余各组大鼠:大鼠双侧腹股沟、腹部、一侧前足趾共4点皮下注射，每点0.2 mL，同时腹腔注射0.2 mL。第16天时将大鼠放入染毒缸内，每次放5只，除A组外用生理盐水雾化，其余各组用2%OVA雾化吸入，1次/d，每次30 min，连续激发20 d。各组雾化30 min前每只大鼠给予药物灌胃干预:A组生理盐水20 mL/kg;B组生理盐水20 mL/kg;C组麻杏二三汤15 mL/kg+生理盐水5 mL/kg;D组地塞米松1 mL/kg+生理盐水15 mL/kg。激发后第一天，模型组可见大鼠烦躁、咳嗽、打喷嚏或行动迟缓、等症状。并从模型组随机抽取一只处死，迅速取下右支气管肺组织浸泡于4%多聚甲醛固定72 h并做病理切片，光镜下观察到支气管和肺泡壁有多种炎性细胞浸润，即哮喘发作激发成功。其余全部各组于末次激发后全部处死，全肺取出称重，左肺迅速置于液氮中备用，右肺浸泡于4%多聚甲醛固定72 h。

1.5 检测各种指标

1.5.1 建造早期哮喘气道重塑模型成功指标 1)动物行为改变:每次哮喘激发过程中，大鼠烦躁不安、频繁咳嗽打喷嚏或行动迟缓、俯仰不动、二便失禁、仰背式呼吸甚则发绀。2)生理指标:大鼠体重显著下降，肺系数明显升高。3)病理学指标:将浸泡于甲醛的肺右叶脱水、包埋、切片，HE染色。并用NYD1000型图像分析软件截取完整的支气管测定管腔的内周长(Pbm)、支气管壁总面积(Wat)、支气管平滑肌面积(Wam)，并用Pbm标准化，即分别以支气管厚度=Wat/Pbm和平滑肌厚度=Wam/Pbm来衡量气道重塑程度。造模成功显示与空白组比支气管壁厚度和气道平滑肌明显增厚。

1.5.2 肺组织TGF-β1和ET-1的检测 取同等重量的左肺组织加等渗盐水匀浆、离心，取其上清液，采用ELLSA法测定TGF-β1、ET-1表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPASS17.0进行统计学处理，数据结果以(¯x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠实验前后体重和肺系数比较 实验前各组大鼠体重无显著统计学意义(P＞0.05)。见表1。实验后各组大鼠体重均不同程度增长，但各组之间存在明显统计学意义(模型组大鼠在哮喘发作过程中死亡2只，不排除灌胃操作不当致死的可能性)，模型组大鼠体重大于空白组、肺系数小于空白组，有统计学意义(P＜0.05);麻杏二三汤组体重大于地塞米松组、肺系数小于地塞米松组，并都有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表1 实验前各组大鼠体重(g)

表2 实验后各组大鼠体重(g)、肺系数(%)

2.2 病理组织学变化 各组大鼠支气管壁厚度和平滑肌厚度增厚，以模型组尤为显著(P＜0.05);与模型组比，两个用药干预组大鼠的体重较大、肺系数较低、气管壁厚度和平滑肌厚度明显降低(P＜0.05)，且麻杏二三汤组支气管壁和平滑肌厚度都低于地塞米松组(P＜0.05)。见表3。

表3 各组大鼠病理学指标(%)

2.3 肺组织TGF-β1和ET-1含量分析 与空白组比，模型组TGF-β1和ET-1含量较高，有统计学意义(P＜0.05);与模型组比，两个药物干预组 TGF-β1和ET-1含量均较低，有统计学意义(P＜0.05)。麻杏二三汤组TGF-β1和ET-1含量低于地塞米松组组，但无统计学意义(P＞0.05)。见表4和图1。

表4 各组大鼠肺组织TGF-β1和ET-1含量(ng/L)

图1 各组大鼠肺组织TGF-β1和ET-1含量

3 讨论

近年来关于哮喘的发病机制有很多学说，其中主要的有:气道炎症学说、神经——受体失衡学说、免疫与变态反应学说。哮喘的传统治法是应用激素类药物对炎症的治疗，而近年多项研究和仍然高发的哮喘表明单纯的抗炎无法彻底治疗哮喘，并在哮喘患者的尸体解剖中发现气道平滑肌和气道管壁的增厚是其明显的病理特征［7-8］，即气道重塑。另有研究表明气道重塑不单出现在重度哮喘患者上，还可在轻度哮喘和哮喘的早期被发现［9］，可推测气道重塑很可能是哮喘不易根治的重要病理基础，而延缓甚至阻止气道重塑也是治疗哮喘的重要方向和难解之题。本课题利用延长OVA激发时间复制哮喘气道重塑模型已得到广泛的认可和应用［10］，而基于哮喘发作时管腔内周长和气道管壁面积保持不变原理，分别将Wat和Wam用Pbm标准化，克服了大小不同、状态不同和切片方向不同气管造成的误差，所得出的比值能客观反映气道重塑的程度，是判断造模效果主要指标。本实验在连续激发哮喘20 d后，模型组支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度明显大于空白组，有统计学意义，即早期哮喘气道重塑造模成功。

TGF-β1是一类多效能的生长调节因子，在细胞的生长、分化、免疫调节及细胞外基质合成调节中有重要作用［11-12］，在哮喘发作过程中主要由肺及气道的嗜酸性粒细胞、成纤维细胞大量释放，并表现在大鼠肺组织TGF-β1显著升高，其下游信号 TGF-β1/Smads活化，同时被释放的TGF-β1反之又刺激了气道上平滑肌细胞和成纤维细胞使其细胞外基质产生和沉积，构成了气道重塑的重要基础。ET-1是机体在缺氧缺血应激状态下产生的一种致损伤因子，它是已知最强烈的缩血管物质和支气管收缩剂，广泛存在于血管内皮细胞、气管、支气管黏膜、平滑肌、肺血管，在体内肺部分布最多，并且哮喘发作时气道上皮含量是最高的，可以通过直接收缩气道平滑肌及刺激花生四烯酸、血小板活化因子、组胺等致使多种炎症释放，使气道高反应性增高，同时使其缺血、缺氧情况更加严重，因此ET-1常用于检测检测患者哮喘严重程度［13］。本实验模型组的肺组织 TGF-β1、ET-1含量明显升高，提示哮喘发作和气道重塑过程中这两个因子都有参与且成正相关。因而具有有效拮抗TGF-β1和ET-1的药物是哮喘治疗中重要的研究方向。

中医认为哮喘发作是人体内环境紊乱基础上加上“非时之感”，即外感六淫或烟尘、毛屑、异味、饮食不当等。本课题用方——麻杏二三汤是我国著名中医专家焦树德的经验方，该方由炙麻黄、杏仁、化橘红、半夏、茯苓、炒苏子、莱菔子、白芥子、诃子、甘草、枇杷叶、茉莉花茶组成。方中麻黄、杏仁归肺经，麻黄宣肺平喘，杏仁降气止咳，一宣一降同为君药;化橘红、半夏和炒苏子、莱菔子、白芥子(三子养亲汤)同为臣药，燥湿化痰、理气消食;茯苓、诃子、茉莉花茶及甘草，健脾利水，补肺润肺共成佐使。现代药理研究表明:麻黄中的有效成分麻黄碱可以间接发挥拟肾上腺素的作用、兴奋支气管α-受体和β-受体来松弛气管平滑肌，麻黄挥发油有明显平喘抗炎祛痰作用，同时麻黄还能调节辅助性T细胞和抑制性T细胞的比例［14］;杏仁和枇杷叶中含有的杏仁苷可以在胃中产生胃微量氢氰酸，促进肺表面活性物质生成，进而减少炎性渗出，同时对呼吸中枢有镇静作用以达到平喘效果［15-16］;半夏含有生物碱、有机酸等多种成分，其中总游离有机酸有明显的镇咳祛痰功效［17］;麻黄、杏仁、半夏三药合用能够降低哮喘患者白介素4、一氧化氮、免疫球蛋白E水平，从而抑制气道炎症和延缓气道重塑［18］;炒苏子、莱菔子、白芥子均可行痰化痰、降气平喘，对非特异性炎症的抑制作用较好［19］;茯苓和化橘红提取物具有抗菌、抗炎、抗病毒作用［20］。诸药合用，共奏化痰蠲饮、降气平喘之功。

总结本次试验结果:1)与实验前相比，实验后各组大鼠体重均有增长，但各组之间体重和肺系数仍存在显著统计学意义:两个药物干预组的大鼠体重较模型组体重数值升高、肺系数降低，且有意义;麻杏二三汤组的大鼠肺系数小于地塞米松组，且有意义。脏器系数可以客观的表现药物对该脏器的毒性作用［21］，因此该实验提示地塞米松的应用仍存在不良反应，长期临床用药及哮喘缓解期可以单用麻杏二三汤。2)与模型组比较，两个用药干预组气道管壁和平滑肌厚度、TGF-β1和ET-1含量都有降低，且有临床意义，表明两种用药方法都对延缓气道重塑方面有一定作用;麻杏二三汤组的气道管壁和平滑肌厚度降低效果优于地塞米松组。但在哮喘发作过程中麻杏二三汤如何降低TGF-β1、ET-1并同各种炎性递质相互作用进而延缓气道重塑有待进一步探讨。

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