益肺胶囊对COPD稳定期疗效及对SIRT1表达的影响

黄红铭 刘 丹 王 鹏 王 缘 杨玉湘

(1四川省凉山州第一人民医院急诊科，凉山，615000;2四川大学华西医院呼吸科，成都，610041;3四川省凉山州州一医院中医科，凉山，615000)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)属于一种呼吸道气流受限疾病，其气流受限多呈现渐进性，即使致病因素去除或者施以强有力的治疗措施，此种进展仍无法避免的，随着疾病发展患者长期存在咳嗽、咳痰、呼吸困难，常因继发心力衰竭、呼吸衰竭而死亡，严重影响患者生活质量，因此美国胸科协会于2010年倡议将提高生活质量作为 COPD稳定期患者的管理目标［1］。SIRT1(Sirtuin Type 1)是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的组蛋白脱乙酰酶，是Sirtuins家族成员之一，具有多种生物学特征，尤其是细胞的炎性反应、基因调控转录密切相关。目前，有关SIRT1与慢性炎症相关性的论文已在诸多杂志上连续刊出［2-4］。

中医学认为COPD稳定期属于“肺胀”范畴，久病肺虚，子盗母气，病必及脾，脾虚运化失司，水湿内生，水气上渍于肺，导致肺胀。本研究使用益肺胶囊从“补肺健脾”角度进行治疗并确有理想效果，但其作用机制并未进行探析。基于此我们猜想，益肺胶囊发挥临床疗效是否与SIRT1表达变化有关?因此我们拟通过检测COPD稳定期患者在使用益肺胶囊后疗效及外周血SIRT1表达量的变化，以期对COPD患者估计预后、指导临床产生积极作用。具体如下。

1 临床资料和方法

1.1 一般资料 本研究选取2010年1月至2014年2月本院呼吸科就诊的COPD稳定期患者共70例，随机分为对照组和治疗组，各35例。其中对照组男性 18例，女性 17例，年龄 41～78岁，平均(55.8±2.8)岁，病程3～29年，平均(14.2±1.3)年;治疗组男性19例，女性16例，年龄40～79岁，平均(56.1±2.2)岁，病程2.5～30年，平均(15.1±1.4)年。2组年龄、性别、病程构成比差异无统计学意义(P＞0.05)，基线一致，具有可比性。本研究方案经过医院伦理学委员会审查批准。

1.2 排除标准 合并心、脑、肝、肾等主要脏器原发性疾病者;合并恶性肿瘤、甲状腺亢进、重度感染者;存在认知功能障碍者;妊娠或者哺乳期者;不予签署知情同意书者。

1.3 稳定期及急性加重的判断标准［5］稳定期:患者咳嗽、咳痰、气短等症状稳定或者症状轻微。急性加重:疾病过程中患者短期内咳嗽、咳痰、气短和(或)喘息加重，痰量增多，呈脓性或者黏液脓性，可伴发热等炎症明显加重表现。

1.4 治疗方法 2组患者均接受呼吸内科常规治疗，包括低流量氧气(1～2 L/min)吸入，纠正电解质紊乱，消炎抗感染。对照组:常规内科基础治疗基础上加用沙美特罗替卡松气雾剂(商品名:舒利迭;规格:50/500μg揿;批号H2009056;厂家:Glaxo Wellcome Production)，每日1吸，每日2吸。治疗组:在对照组治疗基础上加服益肺胶囊(规格:0.3 g/粒;批号Z14021863;厂家:四川省成都市湔江制药厂)，2粒/次，2次/d。益肺胶囊含有:炒党参12 g，炒白术 12 g，北沙参9 g，麦冬9 g，茯苓12 g，淮山药12 g，仙鹤草6 g，川贝母6 g，苏梗6 g，甘草3 g。2组均接受3个月治疗。

1.5 观察指标

1.5.1 肺功能 采用便携式肺功能仪(AS-505型，日本美能公司)为患者进行肺功能检测，令患者配合操作者口令，以最大可能吸气，然后以最大力量、最快速度呼出，注意夹住患者鼻子，嘱患者含紧口嘴，避免测试过程中漏气，以此获得FEV1%预计值。

1.5.2 运动功能测定 采用6 min步行距离试验(6MWD)［6］，试验前检测员须向患者介绍全过程及注意事项，让患者站在约50 m长的平地起始线上，6 min计时开始后，患者在不受干扰的情况下，根据自己的体能决定步行速度，嘱患者行走中不说话不跑跳，折返时不犹豫;必要时允许放慢速度或停下休息。检测员每分钟报时1次，提前15 s告知患者，6 min后试验结束。分为4个等级:1级少于300 m，2级为300～374.9 m，3级为375～449.5 m，4级超过450 m。级别越低心肺功能越差。达到3级与4级者，可说心肺功能接近或已达到正常。

1.5.3 生活质量测定 使用SF-36生活质量表进行调查，是国际上普遍认可的生活质量测评工具，它评价健康相关生活质量(Health Related Quality of Life，HRQOL)的8个维度:生理功能(PF)、生理职能(RP)、躯体疼痛(BP)、总体健康(GH)、活力(VT)、社会功能(SF)、情感职能(RE)和精神健康(MH)，患者的生活质量随着SF-36分值的升高而增加。

1.5.4 SIRT1浓度检测 采集治疗组及对照组人群清晨空腹外周抗凝血2 mL，用人淋巴细胞分离液提取外周血单核细胞(PBMC，1×106/mL)，加入100 μL裂解液，4℃持续振摇30 min，离心(12 000 r/min，20 min)后，将上清转人预冷的离心管，考马斯亮兰法测定蛋白浓度。灌制SDS-PAGE凝胶，凝固后按照说明安装电泳，每孔上样等体积样品与Marker在100 V电压电泳，电泳后用380 mA电流将蛋白转移至硝酸纤维素滤膜，滤膜经5%脱脂奶粉封闭1 h后，剪膜，根据分子量分开后分别以加1∶500稀释的一抗(SIRT1)及内参抗体(β-actin，1∶3 000)室温孵育2 h，洗膜，HRP标记羊抗兔二抗以1∶2 000稀释，继续孵育2 h，TBST漂洗，取出膜，滴加DAB显色液，5 min后封膜，洗片，扫描记录结果，Gel-analyze分析软件分析条带灰度。

1.6 统计学处理 全部数据采用SPSS 19.0进行统计分析，表示为均数±标准差(¯x±s)。数据间先进行方差齐性检验及正态性检验，两项均符者采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD-t检验进行多样本均数间的两两比较。若有一项以上不符，则采用Kruskal-Wallis H检验和Dunn＇s多重检验进行统计分析。计量资料以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺功能变化 2组治疗前肺功能指标无统计学意义(P＞0.05)，治疗后治疗组的FVC、FEV以及FEV/FVC均较对照组明显改善(P＜0.05)，具体见表1。

表1 2组治疗前后肺功能比较(¯x±s)

2.2 2组治疗前后运动功能的比较 治疗前2组运动功能各级别例数无统计学意义(P＞0.05)，治疗后治疗组恢复至3级/4级的例数明显多于对照组，具体见图1。

图1 2组运动功能比较

2.3 2组治疗前后生活质量比较 使用SF-36进行生活质量评估，治疗前2组SF-36总分无统计学意义(P＞0.05)，经过治疗后，2组SF-36总分均有所增加，其中治疗组增加的幅度更明显(P＜0.05)。具体见表2。

表2 2组治疗前后生活质量情况比较(¯x±s)

2.4 2组治疗前后SIRT1浓度的变化 治疗前2组SIRT1蛋白表达无统计学意义(P＞0.05)，经过治疗后2组SIRT1蛋白表达均有所上调，其中治疗组上调得更明显，具体见图2。

图2 2组SIRT1浓度Western-blot的结果

3 讨论

COPD的患者在稳定期虽然病情较为稳定，但稍有不慎，则病情容易反复发作，“治未病”为中医治病、养生的主要指导思想，在《素问·四气调神论》就有提到:“圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱，此之谓也。夫病已成而后药之，乱已成而后治之，譬犹渴而穿井，斗而铸锥，不亦晚乎”。故应在稳定期及对COPD的患者进行治疗，以减少疾病的反复发作。

久病肺虚卫外不固，外邪侵入，气虚宣肃无权导致津液运化失司，积以成痰液，临床表现为咳嗽、咳痰［7］，正如《医学三字经》中描述:“肺为脏腑之华盖，呼之则虚，吸之则满，只受得本然之正气，受不得外来之客气”。故益肺是治疗COPD的根本。同时我们认为由于脾肺为母子关系，子病盗母气，肺气的盛衰在很大程度上取决于脾气的强弱，故有“肺为主气之枢，脾为生气之源”之说。另外，脾肺两脏互相配合，共同参与水液代谢过程。如果脾失健运，水湿不化，聚湿生痰而为饮、为肿，影响及肺则肺失宣降而喘咳。其病在肺，而其本在脾。故有“脾为生痰之源，肺为贮痰之器”之说。反之，肺病日久，又可影响于脾，导致脾运化水湿功能失调，于是，故在调节治疗COPD在益肺的同时应该兼以健脾。本研究采用益肺胶囊，诸药合用共奏益气润肺，健脾理气化痰的功效，与陈士铎《石室秘录》中所描写的“治肺之法，正治甚难，当转治以脾，脾气有养，则土自生金”理念相吻合［8-10］。我们比较了2组患者治疗前后的肺功能、运动能力及生活质量后发现，虽然经过干预后2组患者上述几个方面均得到提升，但是加服益肺胶囊的治疗组患者临床症状、活动能力、生活状况的改善明显优于对照组，说明益肺胶囊在一定程度上减缓了肺功能下降的速度，提升了COPD患者的运动功能及生活质量。

我们使用益肺胶囊得到了理想的临床疗效，为了进一步探讨治疗机制我们对2组患者外周血单核细胞的SIRT1表达量进行检测，Sirtuins［11］是近年来新发现位于细胞核内的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，其中SIRT1是其重要成员，SIRT1通过将转录因子的蛋白进行去乙酰化修饰而达到调控其代谢的目的，有资料［12-13］显示COPD患者肺组织内SIRT1的表达明显较正常人群肺组织低，由于COPD患者体内具有免疫抑制及慢性炎症效应，巨噬细胞在炎性微环境中被趋化聚集，导致P65的乙酰化增强，从而促进SIRT1发生转译后修饰，导致酶活性化或钝化。研究中我们发现益肺胶囊显著增加了SIRT1的浓度，我们认为益肺胶囊提升COPD患者肺功能可能通过上调SIRT1蛋白浓度有关。

综上所述，COPD的发病机制与SIRT1关系密切，而益肺胶囊可以部分减缓该疾病的发展，从而改善患者预后，临床建议推广运用。

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