两种饲用柠檬酸效果的体外评估方法研究

唐茂妍，林冬梅，陈旭东（.上海正正生物技术有限公司，上海　004；.河北工程大学农学院，河北　邯郸　05608；.北京中农颖泰生物技术有限公司，北京　009）



两种饲用柠檬酸效果的体外评估方法研究

唐茂妍1，林冬梅2，陈旭东3
（1.上海正正生物技术有限公司，上海200433；2.河北工程大学农学院，河北邯郸056038；3.北京中农颖泰生物技术有限公司，北京100193）

摘要：试验通过对两种柠檬酸物理特性、化学特性及其对饲料pH、系酸力和有害菌作用效果的评估，比较两种饲用柠檬酸效果的差异。

关键词：体外法；柠檬酸；评估体系

随着欧盟对抗生素禁用条例的颁布，饲用抗生素替代品的研究日益深入，酶制剂、益生素、酸化剂、寡糖等饲用添加剂逐步受到广大生产者和使用者的关注。其中，酸化剂作为无污染、无残留的绿色添加剂，其应用研究已经成为热点，如酸化剂作用的分子机理、不同酸化剂的作用效果对比、酸化剂的组合效应等[1-4]。然而，不同的试验方法、产品组成、添加量和日粮之间的差异均导致研究结果不一致，甚至有些结果截然相反，这些都对酸化剂的使用者造成了困扰，在某种程度上也限制了饲用酸化剂的广泛应用。同时，酸化剂的生产、流通和品质检测控制等方面也缺乏统一标准，目前对于饲用酸化剂的评估还是使用传统动物饲养试验的方法，该方法不仅耗时、费力，并且干扰因素颇多。

本试验设计了一套系统的体外评估方法，这一体系考虑了单体酸特性以及对饲料和有害菌的影响等问题，对复合酸制作时的单体酸选择（或复合酸效果对比）作以探讨，为原料酸的选择与评估建立一种快速、准确的评估体系，从而为酸化剂的生产者、使用者和研究者提供理论支持。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

1.1.1仪器

电子天平（BT124S）、真空干燥箱（DZF-6020）、pH计（FE20K Plus）、微型植物粉碎机（FZ102）、磁力加热搅拌器（79-1）、恒温水浴锅（H.HS4）、生化培养箱（SPX-150B-Z）、立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-30S11）、酸式滴定管、碱式滴定管、平板（直径约85 mm）、游标卡尺等。

1.1.2试剂

配制盐酸溶液和氢氧化钠溶液混合液1 mol·L-1。普通肉汤培养基（批号1303202）、营养琼脂培养基（批号140211）、SS琼脂培养基（批号140432）购自北京三药科技开发有限公司。

1.1.3酸化剂

两种柠檬酸产品（A和B，批号分别为20140221 和20140118）均来自上海正正生物技术有限公司。

1.1.4断奶料

断奶料购自辽宁禾丰牧业股份有限公司沈阳分公司（规格20 kg，批号20131212），饲料主要原料组成为谷实类、饼粕类、鱼粉、碳酸氢钙、石粉、微量元素等。

1.2试验方法

1.2.1酸化剂水分含量测定

复合酸化剂通用要求（GB/T 22141-2008饲料添加剂复合酸化剂通用要求）中水分含量测定使用的是卡尔费休法，该方法在实际使用中要求较高，需掌握的关键控制点较多[5]。因而，在实际生产中，酸化剂水分含量测定方法多采用真空干燥法，具体操作：准确称取样品2～5 g（精确至0.000 1 g）置于烘至恒重的称量皿中，放置于真空烘箱（70℃、真空度93.3～98.6 KPa）烘干5 h，之后取出于干燥皿冷却30 min，称重[6]。样品水分含量的计算公式见式1。

样品水分含量（%）=（样品湿重-样品干重）/样品湿重×100。（1）

1.2.2总磷含量测定

酸化剂样品中总磷含量测定按照GB/T 3149-2004食品添加剂磷酸的测定方法进行。

1.2.3溶液pH测定

称取适量柠檬酸样品，加入去离子水磁力搅拌，配制成1%水溶液，用pH计测定溶液pH。

1.2.4酸化剂缓冲容量测定

缓冲容量（mol·L-1·pH-1）的定义为β=Δb/ΔpH，其中Δb是单位体积缓冲液所加入的一元强碱的摩尔数，ΔpH是单位体积缓冲液加入一元强碱后pH的变化[7]。称取适量两种柠檬酸样品，分别用去离子水、柠檬酸钠配制浓度为0.1 mol·L-1pH为3.0的缓冲溶液100 mL，然后用氢氧化钠溶液1 mol·L-1滴定，使pH达到4.0，记录所用氢氧化钠溶液的毫升数，以所消耗氢氧化钠毫摩尔数作为缓冲溶液的缓冲容量。

1.2.5饲料pH和系酸力测定

饲料pH和系酸力测定方法参照Bolduan方法进行[8]。称取风干断奶仔猪饲料样品（过60目标准筛）100 g放入烧杯中，加入去离子水200 mL，在恒温水浴锅中加热至37℃，放在磁力搅拌器上搅拌，并插入温度计，将温度控制在（37±1）℃。将pH计电极插入溶液中，测定悬浊液pH。用1 mol·L-1盐酸溶液稀释溶液，逐步滴定至pH=4.0时所用盐酸的毫升数即为该饲料的系酸力（所有测定在1 h之内进行完毕）。

在粉碎过筛（过60目筛）的断奶仔猪日粮样品中添加一定比例柠檬酸，混合均匀。按照以上方法，分别测定加酸后饲料的pH和系酸力。

1.2.6对有害菌抑制效果测定

根据张治锬管碟法的操作，在已灭菌平板中加入适量营养琼脂，然后分别加入检定菌液（大肠杆菌2×109cfu·mL-1，沙门氏菌2×108cfu·mL-1），用无菌曲玻棒使之均匀铺于琼脂表面，然后将牛津杯置于平板内，用灭菌加样器将待检酸化剂（1%）加入牛津杯。置于37℃恒温培养箱中培养24 h后，用游标卡尺量取抑菌圈大小[9]。判定标准按照邓来送的方法进行[10]。

2　结果与讨论

2.1理化特性比较

通过对两种柠檬酸理化特性各指标的分析，可知虽同样为柠檬酸，其某些特性还是有显著性差异。酸化剂理化特性包括感官检测（颜色、气味、流散性等）和水分、总磷含量测定等。测定酸化剂中磷含量，主要是考虑到对饲料配方中磷含量的影响，如果酸化剂中磷含量较高，则需在饲料配方中调整其他磷源的添加量[11]。两种柠檬酸水分、总磷含量比较见表1。

由表1可知，两种柠檬酸在物理特性方面无显著差异（P>0.05），均为无色易吸湿结晶，流动性良好，有正常的柠檬酸味。两种柠檬酸水分含量均<10%，两者间无显著性差异（P>0.05）；两种柠檬酸磷含量约为0.2%，两者间无显著性差异（P>0.05）。

表1　两种柠檬酸水分、总磷含量比较

2.2特定浓度溶液酸度评估

酸化剂对饲料pH、系酸力及消化道食糜酸度的影响主要取决于酸化剂酸度的强弱。一般可用两种方法评估：一种方法是一定浓度水溶液的pH测定，此法可间接反映酸化剂的酸化能力，但是目前为止，还没有确定适宜的酸化剂水溶液浓度，有研究认为1%酸化剂水溶液可反映实际情况[11]。另一种方法为在常用仔猪日粮中添加酸化剂后制成悬浊液测定其pH变化，这种方法在实际生产中有指导意义[12]。

唐湘方研究了6省18家有代表性的饲料企业的断奶仔猪日粮pH、系酸力及电解质平衡情况，结果发现，断奶仔猪日粮pH平均为5.91，但其变化范围较大（5.47～6.95）[13]。饲料pH过高，一方面会更多中和胃酸，提高食糜pH，影响胃蛋白酶原的活化，造成消化不良；同时食糜pH升高，为有害菌繁殖和生长提供适宜条件，消化道菌群失衡导致动物细菌性腹泻的发生。从另一方面讲，饲料pH变化范围增大，也增加了酸化剂针对性应用的困难。如果为降低饲料pH，则选用的单酸酸度系数就要低。两种柠檬酸特定浓度水溶液pH比较见表2。

表2　两种柠檬酸特定浓度水溶液pH比较

由表2可知，两种柠檬酸1%水溶液pH均为2.01，两者间没有显著差异（P>0.05）。

2.3酸化剂缓冲容量比较

饲料是由各种复杂的原料组成的缓冲体系，即对于外加的酸碱都有较强的缓冲作用，以保持饲料本身的pH不会发生太大变化。酸化剂一般都是由酸及其盐组成的缓冲对，酸溶液缓冲容量的大小对于其作用的发挥也有着至关重要的作用。

本试验中通过向具有相同pH的两种柠檬酸缓冲液中滴加氢氧化钠溶液（1 mol·L-1），以所用氢氧化钠溶液的毫摩尔数评估两种酸的缓冲容量大小，见图1[7]。

图1　两种柠檬酸缓冲特性比较

由图1可知，柠檬酸B的缓冲容量高于柠檬酸A，以此可推测，同样饲料中分别添加这两种柠檬酸，对于饲料pH和系酸力的影响，柠檬酸B优于柠檬酸A。

2.4对饲料pH的影响

研究表明，酸化剂的主要作用之一就是降低饲料和食糜的pH，从而抑制饲料中有害菌生长，并提高胃中蛋白酶活性，改善饲料中植物性蛋白的消化率，提高动物的生产性能[14]。因而测定加酸饲料pH的变化，成为评估酸化剂效果的重要指标之一。两种柠檬酸对饲料pH和系酸力的影响见表3。

表3　两种柠檬酸对饲料pH和系酸力的影响

由表3可知，特定断奶饲料（pH=6.38）中分别添加柠檬酸A和柠檬酸B后，随酸化剂添加量的增加，日粮pH有降低趋势；添加量为0.5%时，添加柠檬酸B的饲料pH显著低于添加柠檬酸A的饲料pH（P<0.05）。而在较低添加量时二者对于饲料pH的影响无显著差异（P>0.05）。

2.5对饲料系酸力的影响

日粮系酸力（ABC），也称酸结合能力，是指一定日粮中和酸的能力。Bolduan把系酸力定义为使100 g饲料日粮的pH降至4.0时所需要的盐酸毫摩尔数[8]。多数研究认为，饲料系酸力在一定范围内（19.5～23mmol·100g-1）可改善断奶仔猪消化道食糜酸度，维持消化道菌群平衡，保证消化系统的正常生理功能，同时提高断奶仔猪日增重和饲料效率[14-16]。

由表3可知，向特定断奶猪饲料（系酸力为22.61 mmol·100 g-1）中分别添加0.3%和0.5%的两种柠檬酸，随着酸添加量增加，饲料系酸力显著降低（P< 0.05）；同样在0.5%添加量下，添加柠檬酸B的饲料系酸力低于添加柠檬酸A的饲料，而添加浓度为0.3%时，二者对饲料系酸力的影响差异不显著（P> 0.05）。

2.6酸化剂在饲料中的缓释

酸化剂的生产工艺不同对产品本身特性有显著影响，有时为避免酸化剂与饲料中某些成分发生反应，影响其他饲料成分功效，需对酸化剂产品做后处理工艺，如包被等。包被技术原多用于医药产品中。包衣是药剂学中最常用的的技术之一，是指在特定的设备中，按特定的工艺将能成膜的材料，涂覆在药物固体制剂的外表面，使其干燥后成为紧密黏附在表面的一层或多层不同厚薄、不同弹性的功能保护层。在饲料添加剂中的应用则简单的多，现在多为包被材料和芯材物理混合，使芯材外表面涂裹一层包被材料，从而防止芯材与其他成分发生反应。

两种柠檬酸在饲料中的缓释比较见图2。本试验中两种柠檬酸以相同添加量分别添加到特定断奶仔猪料中，加入适量去离子水制成悬浊液，测定不同时间点悬浊液的pH，随时间延长，饲料pH逐渐降低，但1 h后，pH变化趋于平缓；两种柠檬酸添加入饲料后pH变化趋势相同，两者无显著差异（P>0.05）。

图2　两种柠檬酸在饲料中的缓释比较

2.7酸化剂对有害菌的抑制效果

酸化剂添加除了降低饲料pH和系酸力外，还可抑制有害菌的生长。大肠杆菌和沙门氏菌是畜禽消化道中最常见的两种致病菌，均属于革兰氏阴性菌。消化道菌群失衡很容易引起大肠杆菌和沙门氏菌的过度繁殖和生长，从而造成动物腹泻下痢[17-21]。因而常以这两种菌作为评价酸化剂作用效果的指标。两种柠檬酸对有害微生物的抑制作用见表4。

表4　两种柠檬酸对有害微生物的抑制作用mm

在液体培养基中加入相同浓度柠檬酸A和柠檬酸B，抑菌圈直径大小显示了二者对大肠杆菌和沙门氏菌抑制效果。由表4可知，柠檬酸对沙门氏菌的抑制效果优于对大肠杆菌的抑制，同时柠檬酸B对两种有害菌的抑菌圈显著>柠檬酸A（P<0.05）。

3　小结

常用的柠檬酸制备方法是微生物发酵法，因而产品的特性会受到菌种种类、发酵方法以及后处理工艺的影响。试验所用同样纯度的柠檬酸产品，感官特性和物理特性没有显著差别，但两种柠檬酸的化学特性、对饲料的影响和对有害菌的抑制效果均有显著差异。综合本研究所选取的检测指标可以建立一种单酸（或复合酸）的快速评估体系，从而为饲料酸化剂的深入应用提供帮助。

本研究发现，在进行单酸或复合酸的体外评估时，可以通过单酸的化学指标（酸度、缓冲容量等）和对饲料和微生物的影响指标（饲料pH和系酸力变化、有害菌生长抑制效果）作为快速评定指标。

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前沿科技摘编

Study on Assessment the Effect of Two Citric Acid by in vitro Method

TANG Maoyan1, LIN Dongmei2, CHEN Xudong3
（1. Shanghai Zhengzheng Biotechnology, Co., Ltd., Shanghai 200433, China；2. College of Agriculture, Hebei University of Engineering, Handan 056038, Hebei China; 3. Beijing Sinagri Yingtai Biotechnology Co., Ltd., Beijing 100193, China）

Abstract:By assessing the physical properties, chemical properties of two citric acids, pH, acid-binding capaci⁃ty and harmful bacteria effect of feed,the effect of two citric acids were compared.

Key words:in vitro method; citric acid; evaluation system

作者简介：唐茂妍（1976-），女，山东烟台人，博士，主要从事酸化剂的定量应用研究。

收稿日期：2015-03-20

中图分类号：S816.7

文献标志码：A

文章编号：1001-0084（2015）05-0001-05