模糊数学结合响应曲面法优化麻鸭肌原纤维蛋白凝胶工艺*

张志芳，潘道东，2，孙杨赢，曹锦轩，曾小群

1(宁波大学 海洋学院，浙江宁波，315211)2(南京师范大学 食品科学与营养系，江苏南京，210097)

肌原纤维蛋白质热诱导凝胶特性是肉制品加工生产中最重要的功能特性之一［1］。肌原纤维蛋白是盐溶性蛋白，在加热时能够形成凝胶，从而影响肉制品的咀嚼性、硬度和出品率等。肌原纤维蛋白热诱导凝胶特性不仅受蛋白浓度、蛋白分子结构影响，还受加工条件(如加热温度、加热速率)、溶液环境(如pH值、离子强度)等因素的影响［2－4］，因此研究肉制品肌原纤维蛋白热诱导凝胶特性，对肉制品产品的研发与加工具有重要的意义。麻鸭的蛋白含量高，可食部分鸭肉中的蛋白质含量约16% ～25%，比猪肉、羊肉等畜肉含量高，脂肪和胆固醇较于其他肉类低，是很好的现代养生健康食品［5－6］。然而，现今我国在对肌原纤维蛋白凝胶特性的研究方面，大多以猪肉［7］与鸡肉［8］为研究对象。本实验以麻鸭胸肉为研究材料，研究其肌原纤维蛋白的热诱导凝胶特性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

麻鸭，购于浙江宁波镇海江南家禽育种有限公司。(麻鸭日龄为360 d、体重为2 kg，放血去毛取鸭胸脯肉，于－40℃冰箱存放。)

1.2 仪器与设备

PHS-3C pH计，上海雷磁仪器厂;TA-XT2i质构分析仪，StableMicro System公司;美国贝克曼Allerga高速冷冻离心机，贝克曼库尔特有限公司;M200全波长酶标仪，美国Tecan公司;XHF-D高速分散器，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 肌原纤维蛋白的提取制备

肌原纤维蛋白提取参照张玉林［9］方法并稍加改动。取解冻好的鸭胸脯肉加入7.5倍体积的焦磷酸盐饱和缓冲液(100 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，2 mmol/L EDTA-2Na，1 mmol/L DTT，2 mmol/L Na4P2O7，10 mmol/L Maleate;pH 6.8)中，剪碎，匀浆，冷冻离心，去上清取沉淀。将沉淀物重新分散在7.5倍体积的肌原纤维蛋白提取液(100 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，2 mmol/L EDTA-2Na，1 mmol/L DTT，10 mmol/L Maleate;pH 6.8)中，匀浆，冷冻离心，取沉淀，提取的沉淀按上述步骤反复提取，最后一次用纱布过滤。将多次提取的沉淀最后用15 mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤3次，用纱布过滤即得到纯化的肌原纤维蛋白。蛋白浓度用BCA试剂盒测定。

1.3.2 肌原纤维蛋白热诱导凝胶制备

参考李亚楠等［10］的方法，略作修改。选取蛋白浓度、pH、NaCl溶液浓度、蛋白凝胶温度进行单因素实验，改变其中1个因素，其他3个因素水平保持不变。

蛋白浓度:用缓冲溶液(0.6 mol/L NaCl，30 mmol/L Na2HPO4缓冲溶液，pH 6.5)将蛋白浓度分别稀释为20、30、40、50、60、70 mg/mL，水浴加热，从 30 ℃以 0.5 ℃ /min线性升温到70℃，保温40 min，放置4℃冷却。

溶液pH:用缓冲溶液(0.6 mol/L NaCl，30 mmol/L Na2HPO4缓冲溶液)将蛋白浓度分别稀释为40 mg/mL，将溶液 pH 分别调为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，水浴加热，从30℃以0.5℃/min线性升温到70℃，保温40 min，放置4℃冷却。

NaCl浓度:用不同浓度的缓冲溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L NaCl，30 mmol/L Na2HPO4缓冲溶液，pH 6.5)将蛋白浓度稀释到40 mg/mL，水浴加热，从30℃以0.5℃/min线性升温到70℃，保温40 min，放置4℃冷却。

凝胶温度:用缓冲溶液(0.6 mol/L NaCl，30 mmol/L Na2HPO4缓冲溶液，pH 6.5)将蛋白稀释到40 mg/mL，水浴加热，从30℃以0.5℃/min线性升温到 50、60、70、80、90、100 ℃，保温 40 min，于 4 ℃冷却。

1.3.3 凝胶保水性测定

参照 Kocher［11］的方法，蛋白形成凝胶后，在3 000 r/min下离心20 min，对离心前后蛋白凝胶和试管进行称量。蛋白质凝胶的保水性:

WHC/%= ［(m1－m)/(m2－m)］×100

式中:m1为离心后试管与蛋白凝胶的质量;m2为离心前试管和蛋白凝胶的质量;m为离心管质量。

1.3.4 凝胶质构分析测定

参照Marta［12］的方法略有改动。采用TA-XT2i质构分析仪对蛋白凝胶质构特性进行分析，参数设置为:测试探头(P/5)，测前速度 l.0 mm/s，测试速度l.0 mm/s，剌穿距离3 mm，感应力5 g，停留时间5 s。利用自带软件得到蛋白凝胶的相关质构参数:黏性、硬度、弹性。每个指标重复测定5次，取平均值。

1.3.5 蛋白凝胶的综合素质评定

参照赵紫薇等［13］的方法略作改动。根据蛋白凝胶样品质量的指标内容，以及保水性、硬度、弹性、黏性4个因素对蛋白凝胶的重要程度的不同。设定权重向量A和蛋白凝胶样品质量指标集U，计算蛋白凝胶的综合评价得分。

各个因素的权重向量 A=(a1，a2，a3，a4)=(0.3，0.3，0.2，0.2)，并且 a1+a2+a3+a4=1。

1.3.6 响应曲面分析法实验

根据Box-Behnken设计原理，选取溶液pH、Nacl浓度、凝胶温度这3个因素在3个水平上进行响应曲面实验，响应值为蛋白凝胶的综合评价得分。共计17组实验，5个中心点。

表1 响应曲面实验设计因素及水平表Table 1 Factors and levels for response surface analysis

1.3.7 数据处理及分析

本实验每个数据处理设5个重复，采用SPSS 16.0软件分析各个因素对凝胶特性的影响程度和显著性分析，当P＜0.05时为差异显著。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 蛋白浓度对蛋白凝胶特性的影响

由图1可以看出，蛋白凝胶的保水性、硬度、黏性、弹性均随着肌原纤维蛋白浓度的升高而显著升高(P＜0.05)。蛋白凝胶的保水性随着蛋白浓度的增加而升高是因为随着蛋白质溶解度的增加，高密度蛋白形成的纤维相互交错，从而形成紧密且稳定的立体状网络结构［14］。蛋白凝胶硬度主要取决于蛋白在热诱导条件下相互交联的种类和数量，随着蛋白浓度的增加，蛋白溶解度升高，蛋白相互交联数量增加，硬度增强。徐幸莲［15］在研究蛋白质浓度对兔骨胳肌肌球蛋白热凝胶特性的影响中提出凝胶硬度随着蛋白浓度的增加而升高，与本试验的研究结果相一致。

2.1.2 pH值对蛋白凝胶特性的影响

溶液pH值对肌原纤维蛋白凝胶保水性的影响差异极显著(P＜0.01)。由图2可知，蛋白凝胶保水性呈现先下降后升高的趋势，当溶液pH值为5和pH值为5.5时，蛋白凝胶保水性非常低，这是因为溶液pH值靠近肌原纤维蛋白等电点，蛋白质溶解度小。随着溶液pH值的逐渐升高，蛋白所含静电荷增加，静电斥力增加，蛋白质束缚水的能力增强，保水性随之升高。Lyons等［16］提出随着溶液pH值的升高，肌原纤维蛋白凝胶保水性增加，与本试验结果基本一致。

图1 蛋白浓度对凝胶保水性(a)，凝胶质构特性(b)的影响Fig.1 Effect of protein concentration on water holding capacity(a)，and textural properties of the gel(b)

不同pH条件下，蛋白凝胶硬度差异显著(P＜0.05)。随着pH值的增加，蛋白凝胶硬度呈现上升趋势，这是因为在溶液pH值较低的条件下易于形成细线型的蛋白凝胶，而当溶液pH值较高时则有利于形成颗粒状的蛋白凝胶。在不同溶液pH值下，弹性的变化不大，差异不显著。溶液pH对蛋白凝胶黏性的影响差异极显著(P＜0.01)。当溶液pH值为7.0时，形成的蛋白凝胶黏性最大。

图2 pH值对凝胶保水性(a)，凝胶质构特性(b)的影响Fig.2 Effect of pH on water holding capacity(a)，and textural properties of the gel(b)

2.1.3 NaCl对蛋白凝胶特性的影响

在不同NaCl溶液浓度条件下，蛋白凝胶保水性差异极显著(P＜0.01)(图3)。蛋白凝胶保水性随着NaCl溶液浓度的升高而增加，在NaCl溶液浓度为0.8 mol/L时，上升趋势变缓，与浓度为0.6、1 mol/L时差异不显著(P＞0.05)。Bertram 等［17］的研究表明，蛋白凝胶保水性随溶液离子强度的增加而增加。Chantrapornchai等［18］提出凝胶的保水性，在一定溶液离子强度范围内，随着盐溶液浓度的增加而增加，但盐浓度过高会导致溶液渗透压增加，造成蛋白凝胶脱水，凝胶保水性会有所下降。

凝胶硬度随着NaCl溶液浓度的增加呈现上升趋势，这是由于蛋白质的溶解度随着NaCl溶液浓度增加而升高，蛋白交联数量增多，并且溶液中的Na+、Cl－能够与蛋白表面的电荷中和，从而进一步促进蛋白质分子之间的相互作用［19］。蛋白凝胶弹性、黏性的变化趋势跟凝胶硬度大致相同，但其最高点分别为NaCl溶液浓度0.8、0.4 mol/L，而后逐渐降低。

图3 NaCl溶液浓度对保水性(a)和凝胶质构特性(b)的影响Fig.3 Effect of NaCl concentration on water holding capacity(a)，and textural properties of the gel(b)

2.1.4 温度对蛋白凝胶特性的影响

不同加热温度条件下，形成的蛋白凝胶保水性差异显著(P＜0.05)(图4)。在加热温度为50℃时，凝胶保水性很低，这是由于当加热温度低于55℃时，蛋白质重链及头部不会形成凝胶结构，只有当温度高于60℃时，头部才能促成凝胶网络结构的形成［20］。在加热温度为70℃时，蛋白凝胶保水性最大，随着温度进一步升高凝胶保水性呈现下降趋势，这可能是因为聚集现象使蛋白网络状结构破坏，蛋白凝胶失水，凝胶的保水性下降［21］。

图4 温度对凝胶保水性(a)和凝胶质构特性(b)的影响Fig.4 Effect of heating temperature on water holding capacity(a)，and textural properties of the gel(b)

凝胶硬度随着温度的升高，呈现上升趋势，在温度为80℃时硬度达到最大值，这是因为蛋白凝胶硬度与蛋白质变形有关，在一定范围内，加热温度越高，蛋白质变形程度越高，功能基团暴露的就越多，凝胶硬度随之越大［22］。蛋白凝胶黏性和弹性随着温度的升高，呈现下降趋势，这是因为随着温度的升高，蛋白变形加剧，蛋白凝胶胶黏性下降。

2.2 蛋白凝胶样品综合评价

根据蛋白凝胶的保水性、硬度、弹性和黏性所占的权重不同，应用公式Y=A×U分别计算出Box-Behnken实验中的凝胶综合评价得分。

2.3 响应面实验设计结果及数据分析

表2为响应面实验设计及结果。对实验数据进行二元多次回归分析，并建立蛋白凝胶综合评价得分与pH(A)、NaCl浓度(B)、温度(C)实际值的数学回归模型 Y=－5.554 1+1.357 7A+1.531 62B+0.025 843C－0.005AB－0.000 2AC－0.003 125BC－0.096 300A2－1.020 62B2－0.000 163 25C2。

分析数据，模型P值＜0.000 1，可知模型极显著;模型的Lack of Fit的P值为0.088 9，大于0.05。说明模型可用于实际值的预测，试验方法可靠，能够满足响应曲面的分析要求。

由表3还可知，蛋白凝胶综合评价得分的回归方程的回归系数R2=0.987 4，表明有98.74%的数据可以由此方程解释。影响蛋白凝胶综合评价得分的一次项主要顺序为B(极显著)＞A(不显著)＞C(不显著)。交互项中只有BC存在显著的交互影响，二次项A2、B2影响极显著。

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Box-Behnken design and response values

2.4 响应曲面分析

图5是响应曲面的三维图。根据表3可知，BC存在显著的交互影响，分析BC交互影响的响应面图，随着NaCl浓度的升高，蛋白凝胶综合评价得分呈先增大后减小的趋势;而随作温度的升高，蛋白凝胶综合评价得分在不同NaCl浓度条件下变化趋势不同。在NaCl浓度为0.4 mol/L时，凝胶综合评价阵随温度的升高平缓的升高;在NaCl浓度为0.6 mol/L时呈先升后下降;而在NaCl浓度为0.8 mol/L时，温度对凝胶综合评价影响很小。

图5 各相互因素对蛋白凝胶综合评价得分(Y值)影响的响应曲面图Fig.5 Effects of each factor on Y value by response surface analysis

表3 回归模型系方差分析表Table 3 Analysis of variance for response surface reduced quadratic model

通过Design-Expert 8.00软件分析得到蛋白凝胶综评价得分最高可达到0.543，此时的各因素的工艺条件为:pH值6.96、NaCl浓度0.63 mol/L、凝胶温度71.57℃。

采用优化后的实验条件进行验证实验，为了方便，参数定为pH 7.0、NaCl浓度0.6 mol/L、凝胶温度72℃。经过5次平行实验，最后所得Y值为0.541，与理论值0.543非常接近，可见所确定的模型能够较好地预测实验结果。

4 结论

通过单因素实验和模糊数学结合相应曲面优化法实验，建立了综合评价鸭肉肌原纤维蛋白凝胶特性的二次多项式模型。经过实验验证，证明通过响应曲面确定的该模型是合理的，能够较好地预测蛋白凝胶的综合性质，能够从Y值对蛋白凝胶特性进行综合的评价。通过模型分析和实验修正后得到的最佳工艺参数是:蛋白浓度 40 mg/mL、pH 7.0、NaCl浓度0.6 mol/L、凝胶温度72℃。该条件下所制备的凝胶的综合评价得分为0.541。

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