豆甾醇在大豆磷脂脂质体中的抗氧化作用*

左玉，李鹏鸽，朱瑞涛，张彩凤，谢文磊

1(太原师范学院化学系，山西太原，030031)2(河南工业大学化学 化工学院，河南 郑州，45001)

植物甾醇是天然植物中的一种活性成分，具有良好的生物活性和特有的物理化学性质，广泛应用于食品、医药、化妆品和化工等行业，是全世界最受关注的功能性食品因子之一［1－3］。人类已经发现40多种较为主要的植物甾醇，在各种植物甾醇中，含量最多的是谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇［4］。多项研究表明，大部分植物甾醇具有一定的抗氧化能力。

目前，有关植物甾醇中的豆甾醇的性质和作用已有很多文章进行了综述，但对其抗氧化活性的研究，特别是在如生物膜这样的复杂体系下用多种抗氧化指标对豆甾醇抗氧化活性的研究鲜有文章予以总结。为了解豆甾醇在生物体系中的抗氧化作用，本研究用大豆磷脂脂质体模拟非均相生物体系，用水溶性的偶氮化合物AAPH热分解生成的自由基引发脂质氧化，通过硫氰酸铁法(FCT)和硫代巴比妥酸反应物法(TBARS)检测脂质的氧化进程，研究豆甾醇的抗氧化活性以及VC和VE对其抗氧化活性的影响。以期明确豆甾醇及其协同作用的抗氧化机理，为进一步应用于生命体的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆甾醇(stigmasterol，95%)，大豆磷脂，2，2-偶氮(2-脒基丙烷)、HCl，叔丁基对苯二酚(TBHQ)(纯度＞97%)，抗坏血酸(VC)，α-生育酚(VE)，FeCl2·4H2O(含量 ＞ 99.7%)，2-硫代巴比妥酸(TBA)，三氯乙酸(TCA)，NH4SCN(含 量 ＞ 98.5%)，NaH2PO4，Na2HPO4，NaCl，三氯甲烷、无水乙醇。所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 仪器

SHZ-C水浴恒温振荡器，江苏省金坛市华锋仪器有限公司;722S型分光光度计，巩义市英裕予华仪器厂;KQ-100超声波清洗仪，巩义市英裕予华仪器厂;SHZ-DA(Ⅲ)循环水式真空泵，巩义市英裕予华仪器厂;旋转蒸发器RE-52C，巩义市英裕予华仪器厂;80-1型离心沉淀机，江苏姜堰市天力医疗器械有限公司;TL80-2型医用离心机，江苏姜堰市天力医疗器械有限公司;101-2S型电热恒温鼓风干燥箱，上海路达实验仪器厂;BS224S万分之一电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司;微量加样器(10～100 μL)，上海青花仪器厂;微量加样器(100～500 μL)，上海求精生化试剂仪器有限公司。

1.3 主要试剂的配制方法

1.3.1 磷酸盐缓冲液的配制

称取 Na2HPO44.799 1 g，NaH2PO41.029 7 g，NaCl 8.500 g加二次蒸馏水溶解定容至1 000 mL(0.02 mol/L)，pH 7.4(21 ℃)。

1.3.2 AAPH溶液的配制

称取0.500 0 g AAPH，加缓冲溶液溶解定容至100 mL。

1.3.3 Tween 20的配制

称取5.000 0 g Tween20，加缓冲溶液溶解定容至250 mL。

1.3.4 FeCl2、NH4SCN溶液的配制

称取0.994 0 g FeCl2·4H2O，用25 mL浓 HCL(36% ～38%)溶解，然后用二次蒸馏水定容至250 mL，振荡摇匀。

称取75 g NH4SCN，加二次蒸馏水溶解定容至250 mL。

1.3.5 TBA储备液的配制

称取0.720 0 g硫代巴比妥酸(TBA)，加二次蒸馏水溶解(可加热助溶)定容至250 mL;再称取50 g三氯乙酸(TCA)，加二次蒸馏水溶解并定容至250 mL。然后将TBA与TCA按1∶1混合均匀，置于棕色瓶中备用。

1.3.6 TBHQ溶液的配制

称取0.200 0 g TBHQ，加二次蒸馏水溶解定容至250 mL。

1.3.7 豆甾醇溶液的配制

称取0.008 0 g豆甾醇，用CHCl3溶解至100 mL。

1.4 实验方法

1.4.1 大豆磷脂脂质体的制备

大豆磷脂脂质体的制备参考Aihua等人的薄膜法［5］进行。称取10.0 g大豆磷脂，用CHCl3溶解定容至250 mL(40 mg/mL)，储存于冰箱中备用。再量取10.0 mL磷脂的CHCl3溶液于100 mL圆底烧瓶中，45℃减压蒸去CHCl3，加入一定量的磷酸盐缓冲溶液，在超声波振荡器中振荡20 min，制备脂质体，脂质体溶液呈乳白色不透明状。在测定豆甾醇抗氧化性能时，豆甾醇的氯仿溶液预先与磷脂溶液混合，然后减压蒸去CHCl3。

1.4.2 脂质的氧化

本研究采用AAPH作为引发剂，加速大豆磷脂脂质体的氧化。

向大豆磷脂脂质体分散液中加入0.5 mL AAPH后，置于水浴恒温振荡器中(转速约为175 r/min)，恒温37℃发生氧化反应。在脂质体中抗氧化剂的添加量分别为0.001 6、0.004、0.008 mg/mL(浓度相当于磷脂质量的0.02%、0.05%、0.10%)，分别考查不同浓度豆甾醇对大豆磷脂脂质体氧化的影响。按照方法1.4.3，每隔1.5 h定时取样进行分析，用FTC法和TBARS法检测脂质的氧化进度，同时做空白实验。所有实验均采用同一规格的仪器进行操作，且每组实验均作双份平行样，重复做3次，结果以平均值表示。

1.4.3 抗氧化活性的测定

1.4.3.1 硫氰酸铁法(ferric thiocyanate method，FTC)

实验采用 Mitsuda［6］和 Yen 等［7］的方法。每隔1.5 h取0.1 mL的反应液，加入4.7 mL体积分数75%乙醇与0.1 mL 300 mg/mL NH4SCN，再加入0.1 mL 0.02 mol/L的FeCl2/3.5%HCl溶液，室温反应3 min，于500 nm处测吸光度。吸光度值与过氧化物的量符合朗伯-比尔定律。

1.4.3.2 硫代巴比妥酸反应物法(Thiobarbituric acid-reactive substances，TBARS)

采用Kosugi等人的方法测定MDA［8］，并稍有改动。具体步骤如下:每隔1.5 h取0.5 mL的反应液，加入2 mL 2.8 mg/mL的 TBA、2 mL 200 mg/mL的TCA并和1 mL 0.8 mg/mL的TBHQ(为了防止脂质过氧化产物与TBA共热时分解继续生成可与TBA反应物质，在加热时可加TBHQ以终止氧化反应)。然后，置于沸水浴加热20 min，自来水冷却约10 min，加入2 mL CHCl3后，3 000 r/min离心10 min。取上清液在532 nm处测其吸光度。

1.5 抑制率的计算

其中，ODt空白和 ODt样品分别为 t时间空白试验和对应时间点被测样品的吸光度。

1.6 数据处理与分析

每次实验至少平行进行3次，采用Microsoft Excel和Origin 8.0数据分析软件对实验数据进行计算和相关统计学分析，并以平均值 ±标准偏差(SD)表示，采用单因素方差分析(ANOVA)。对各组数据采用方差分析，P＜0.05有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同浓度豆甾醇抗氧化活性的比较

在大豆磷脂脂质体中，不同浓度的豆甾醇均表现出较好的抗氧化活性，但2种方法所得的结果并不相同。这说明豆甾醇可以作为一种抗氧化剂应用于生命体系。也曾有研究者发现，像橄榄油、玉米胚芽油及小麦胚芽油这些油类物质中富含植物甾醇，因而能使部分油脂如红花籽油保护其脂肪酸不发生氧化降解，显示出一定的抗氧化活性。芬兰Lampi等人［9］的研究也表明了如豆甾醇、谷甾醇等的植物甾醇在高温条件下对高油酸葵花籽油具有一定的抗氧化能力。而且，这种抗氧化效果与其自身分子结构和所产生的氧化产物有关。

实验表明，豆甾醇的加入量与吸光度值变化量之间不存在数值依赖关系，并不是加入的豆甾醇越多，对脂质氧化的抑制程度越高。图1-A所示的FTC法中，3种浓度抗氧化活性强弱顺序为:0.008 mg/mL＞0.001 6 mg/mL＞0.004 mg/mL，抑制率分别是37.21%、36.63%和34.88%(显著性分析结果表明P＜0.05，以下均相同)。图1-B所示的TBARS法中，浓度为0.004 mg/mL的添加量表现出最佳的抗氧化能力，其次为0.008 mg/mL的添加量，添加量最少的浓度相应抗氧化活性最小。抑制率按浓度由小到大的排列顺序为:52.55%(0.001 6 mg/mL)、61.31%(0.004 mg/mL)和 56.20%(0.008 mg/mL)。

图1 不同浓度豆甾醇在大豆磷脂脂质体中对脂质过氧化物(FTC)(A)和MDA生成量的影响(TBARS)(B)Fig.1 Effect of different concentrations of stigmasterol on oxidative stability in soybean PC liposome in the presence of 15 μM AAPH at 37℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS.A control was without sample

分析豆甾醇的结构发现，豆甾醇的不饱和度较高，易形成稳定的自由基，阻止脂肪酸链的氧化反应，其机制可参考图2所示。

2.2 不同浓度豆甾醇和VC共同作用时的抗氧化活性

抗氧化剂的协同作用是指多种抗氧化剂的复合体的抗氧化效果强于单一抗氧化剂的抗氧化效果。协同作用不是抗氧化剂复合体中各个抗氧化成分抗氧化性能的简单加合或相乘，而是它们在不同方面发挥不同作用，使整个复合体的抗氧化效果增强。

图2 豆甾醇的抗氧化机理Fig.2 The possible anti-lipid oxidation mechanism of stigmasterol.

本研究所得实验数据协同作用的判定采用如下的两种分析方法。一为加和法:Y=P(x1+x2)－(Px1+Px2)，其中，P(x1+x2)为抗氧化剂复合体的抑制率，Px1、Px2分别为复合体中的单一组分在相同浓度下的抑制率。Y为正值说明存在(正)协同作用，Y为负值说明不存在协同作用(或负协同作用)。这种分析方法适用于单一组分的抗氧化活性相差很大的情况。二为直接比较法，一般在单一组分的抗氧化活性相近的情况下使用。若抗氧化剂复合体的抑制率大于等浓度的单一组分的抑制率，表明存在协同作用，反之无协同作用。

对豆甾醇和0.001 6 mg/mL VC对大豆磷脂过氧化物生成的抑制作用进行了研究(FTC法)，实验结果见图3-A。如图3所示，0.001 6 mg/mL VC，0.001 6、0.004、0.008 mg/mL 豆甾醇，0.001 6 mg/mL 豆甾醇+0.001 6 mg/mL VC，0.004 mg/mL豆甾醇 +0.001 6 mg/mL VC和0.008 mg/mL豆甾醇 +0.001 6 mg/mL VC在反应结束时的抑制率分别是24.71%、36.63%、34.88%、37.21%、50.58%、53.78% 和55.81%。在相同浓度豆甾醇的基础上加入0.001 6 mg/mL VC，抑制率提高了近2倍，脂质氧化的进程显著延长。采用加和法考察协同作用，Y1=50.58%－36.63% －24.71% = －10.76% ＜ 0，Y2=53.78%－34.88% －24.71% = －5.81% ＜ 0，Y3=55.81% －37.21% －24.71%= －6.11% ＜ 0，说明不具有协同作用。在用FTC法检测的同时，采用TBARS法检测反应后期分解产物的生成情况，实验如图3-B，上述各浓度抗氧化剂的抑制率分别是49.66%、52.55%、61.31%、56.20%、61.31%、50.96%和49.04%。用加和法检验其协同作用:Y1=61.31% －52.55% －49.66% ≪ 0，Y2=50.96%－61.31% －49.66% ≪ 0，Y3=49.04% －56.20%－49.66% ≪0，Y值均小于0，表明复合抗氧化剂不显示协同作用。

当VC的浓度为0.008 mg/mL时，考察了在大豆磷脂脂质体中与豆甾醇的协同作用，实验结果如图4所示。

图3 不同浓度豆甾醇对0.001 6 mg/mL VC在大豆磷脂脂质体中对脂质过氧化物(FTC)(A)和MDA生成量的影响(TBARS)(B)Fig.3 Interaction of stigmasterol and ascorbic acid(0.001 6 mg/mL)on oxidative stability in soybean PC liposome in the presence of 15 μmol/L AAPH at 37 ℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS.

图4 不同浓度豆甾醇对0.008 mg/mL VC在大豆磷脂脂质体中对脂质过氧化物(FTC)(A)和MDA生成量的影响(TBARS)(B)Fig.4 Interaction of stigmasterol and ascorbic acid(0.008 mg/mL)on oxidative stability in soybean PC liposome in the presence of 15 μmol/L AAPH at 37 ℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS.

0.008 mg/mL VC，0.001 6、0.004、0.008 mg/mL豆甾醇，0.001 6 mg/mL豆甾醇 +0.008 mg/mL VC，0.004 mg/mL豆甾醇 +0.008 mg/mL VC和0.008 mg/mL豆甾醇 +0.008mg/mL VC的抑制率分别是30.23%、36.63%、34.88%、37.21%、37.21%、32.27%和37.21%(图5)。而TBARS法得到的抑制率分别是 61.31%、52.55%、61.31%、56.20%、23.36%、20.44%和11.68%(图5)。图4-A中的氧化曲线的变化情况基本没有差别，吸光度值和抑制率也相差不大，而在TBARS法中(图4-B)，VC和豆甾醇共同作用时的曲线均位于单一VC或豆甾醇的氧化曲线之上，表明复合抗氧化剂的抗氧化能力均低于单一抗氧化剂，并不显示协同增效作用，而是有一定的助氧化作用，说明了抗氧化剂对氧化初期和终期产物的抑制作用有一定的区别。

协同抗氧化过程是抗氧化剂间的一种普遍现象，也是一个比较复杂的过程。有研究显示，β-胡萝卜素和VE混合后比单一成分对于防止癌变及抑制早期肿瘤更有效［10］，茶多酚对 VE及 VC都有保护作用［11－12］等。但其机理，还有待人们的进一步研究。

图5 不同浓度豆甾醇和VC共同作用时对大豆磷脂脂质体氧化的抑制率Fig.5 Antioxidant activity of stigmasterol and its interaction with ascorbic acid in soybean PC liposome.

2.3 不同浓度豆甾醇和VE共同作用时抗氧化活性的研究

图6、图7表明了不同浓度的豆甾醇和不同浓度的VE在大豆磷脂脂质体中对脂质氧化的影响。从图6-A中抗氧化剂对脂质过氧化物的抑制作用可得出，0.001 6 mg/mL VE，0.001 6、0.004、0.008 mg/mL豆甾醇，0.001 6 mg/mL豆甾醇 +0.001 6 mg/mL VE，0.004 mg/mL豆甾醇 +0.001 6 mg/mL VE和0.008 mg/mL豆甾醇 +0.001 6 mg/mL VE的抑 制 率 分 别 为 35.76%、36.63%、34.88%、37.21%、47.38%、50.00%和 50.29%(图 8)。在添加豆甾醇的磷脂脂质体中加入0.001 6 mg/mL VE，其抗氧化活性增加，且随着豆甾醇浓度增加，抗氧化作用也增加。用加和法考察协同作用:Y1=47.38% －35.76% －36.63%= －25.01% ＜ 0，Y2=50.00% －35.76% －34.88%= －20.64% ＜ 0，Y3=50.29% －35.76% －37.21%=－22.58% ＜0，这说明复合抗氧化剂不显示协同作用。图6-B所示的TBARS法的结果却与FTC法的结果有较大差异，VE的加入使得532 nm处的吸光度值从反应开始时就开始减小，并始终保持减小的趋势。在反应的最后阶段，3种复合抗氧化剂的吸光度值已降至0.003、0.009和0.012，抑制率分别是93.27%、89.42%和63.46%，由于吸光度值的变化趋势不符合一般规律，无法从抑制率的大小来判断复合抗氧化剂抗氧化活性的强弱以及体系中是否存在抗氧化协同增效作用，出现这种现象的原因尚不清楚。

图6 不同浓度豆甾醇和0.0016 mg/mL VE在大豆磷脂脂质体中对脂质过氧化物(FTC)(A)和对MDA生成量的影响(TBARS)(B)Fig.6 Interaction of stigmasterol and α-tocopherol(0.0016 mg/mL)on oxidative stability in soybean PC liposome in the presence of 15 μM AAPH at 37 ℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS.

0.008 mg/mL VE与不同浓度豆甾醇共同作用的结果如图7所示。由图7-A中FTC法的实验结果可得出，0.008 mg/mL VE，0.001 6、0.004、0.008 mg/mL豆甾醇，0.001 6 mg/mL豆甾醇 +0.008 mg/mL VE，0.004 mg/mL豆甾醇 +0.008 mg/mL VE和0.008 mg/mL豆甾醇 +0.008 mg/mL VE的抑制率分别为40.70%、36.63%、34.88%、37.21%、54.05%、56.63%和57.61%(图8)。以加和法考察其协同作用，Y1=54.05% －40.70% －36.63%=－33.28%＜0，Y2=56.63% －40.70% －34.88%= －18.95%＜0，Y3=57.61% －40.70% －37.21%= －20.30%＜0，说明复合抗氧化剂不显示协同增效作用。由图7-B中TBARS法的试验结果可得，上述各浓度抗氧化剂的抑制率分别是51.82%、55.25%、61.31%、56.20%、75.00%、71.15%和69.23%。该实验结果表明，0.008 mg/mL VE的加入，增加了复合物的抗氧化能力，虽然在反应的7.5～9 h，FTC法和TBARS法的吸光度值开始呈下降趋势，2种抗氧化剂的总抗氧化活性有所下降，但与单一豆甾醇的抗氧化活性相比，仍具有较好活性。

图7 不同浓度豆甾醇和0.008 mg/mL VE在大豆磷脂脂质体中对脂质过氧化物(FTC)(A)和对MDA生成量的影响(TBARS)(B)Fig.7 Interaction of stigmasterol and α-tocopherol(0.008 mg/mL)on oxidative stability in soybean PC liposome in the presence of 15 μmol/L AAPH at 37 ℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS.

图8 不同浓度豆甾醇和VE对大豆磷脂脂质体氧化的抑制率Fig.8 Antioxidant activity of stigmasterol and its interaction with α-tocopherol in soybean PC liposome.

3 结论

用大豆磷脂脂质体模拟非均相生物体系，用FTC法和TBARS法研究豆甾醇在非均相体系中的抗氧化活性，并考察了VC和VE对其抗氧化活性的影响，结果表明:在大豆磷脂脂质体中，不同浓度豆甾醇均具有抗氧化活性，但不同体系中其抗氧化活性并不相同。此外，在大豆磷脂脂质体中，TBARS法测得0.001 6 mg/mL VE的加入使复合抗氧化剂抑制脂质氧化后期产物生成的量随时间增长呈下降趋势。

这说明豆甾醇作为抗氧化剂具有较好的应用前景。对其药理学、毒理研究，对于食品科学、生命科学和深入理解抗氧化剂的保健功能具有重要意义。

［1］ Daguet D.Phytosterol:highly promising compounds［J］.Lipid Technology，2000(12):77－80.

［2］ Baker V A，Herpurn P A，Kennedy S J，et al.Safety evaluation of phytosterol esters.Partl.Assessment of oestrogenicity using a combination of in vivi and in vitro assays［J］.Food and Chemical Toxicology，1999，37(1):13－22.

［3］ Toivo J，Phillips K，Lampi A M，et al.Determination of sterols in foods:recovery of free，esterified，and glycosidic sterols ［J］.Journal of food composition and analysis，2001，14(6)，631－643.

［4］ Awad A B，Fink C S，Trautwein E A，et al.β-Sitosterol stimulates ceramide metabolism in differentiated Caco2 cells［J］.Journal of Nutritional Biochemistry，2005，16(11):650－655.

［5］ AihuaI Z，Qiang G.，Quan G H，et al.Interaction of malachite green with lecithin liposomes［J］.Colloids and Surfaces A:Physicochem.Eng Aspects，2003，224(1－3):75－82.

［6］ Mitsuda H，Yasumoto K，Iwami K.Antioxidative action of indole compounds during the autoxidation of linoleic acid［J］.Eiyo Shokuryou，1966，19:13－19.

［7］ Yen G C，Hsieh C L.Antioxidant activity of extracts from Du-zhong(Eucommia ulmoides)toward various lipid peroxidation models in vitro ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46(10):574－578.

［8］ Kosugi H，Kojima T，Kikugawa K.Thiobarbituric acid reactive substances from peroxidized lipids ［J］.Lipids，1989，24(10):873－881.

［9］ Lampi A M.A study on the influence of fucosterol on thermal polymerisation of purified high oleic sunflower triacylg-lycerols［J］.Journal of the science of food and agriculture，1999，79:573－579.

［10］ Paola P，Morman I.Krinsky［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，1992，297(1):184－187.

［11］ 胡秀芳，沈生荣，朴宰日，等.茶多酚抗氧化机理研究现状［J］.茶叶科学，1999，19(2):93－103.

［12］ 王绍美，黄美霞，卿晓红，等.茶多酚与VC对猪油乳化体系协同抗氧化性研究［J］.食品科学，2000，21(10):22－26.