蓝莓酒主发酵前后挥发性成分变化的GC-MS分析

曹雪丹，李二虎，方修贵，赵凯，周伟东

1(浙江省柑桔研究所，浙江台州，318020)2(华中农业大学食品科学技术学院，环境食品学教育部重点实验室，湖北武汉，430070)3(浙江蓝美农业有限公司，浙江 诸暨，311812)

蓝莓(Blueberry)，为杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium spp.)多年生落叶或常绿灌木。蓝莓果实不仅味道鲜美，而且营养丰富，被誉为“世界浆果之王”。研究发现，蓝莓富含的花色苷具有促进视红素再合成、抗炎症、抗癌、延缓衰老、提高免疫力等多种生理活性功能，经常食用可明显增强视力、消除视疲劳、增强心脏功能，而且能延缓脑神经衰老，有效预防尿路感染，减少某些癌症和早性老年痴呆病的患病风险［1－2］。以蓝莓作为酿造原料的发酵酒是一种类似干红葡萄酒的新兴果酒，随着人们生活水平的提高，蓝莓酒不仅保证了酿酒原料的营养价值及保健功能，且更加符合现代人们追求绿色和健康的理念。

顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)是一种快速的样品分析预处理新技术，可以简化样品提取过程，提高分析的速度和灵敏度，因其具有方法简单、无需试剂、提取效果好、变异系数小等诸多优点，已在环境、食品、生化、医学等领域有所应用［3］。张春雨等［4－5］采用静态顶空和气相色谱-质谱联用技术，研究了高丛和半高丛越橘果实香气成分，分别检测出67种和39种挥发性成分。陈雪等［6］采用水蒸气蒸馏萃取法对3个地区越橘酒的挥发性成分进行萃取并分析，共检测到主要挥发性物质40种，其中普遍存在的成分有21种。严红光等［7］和盖禹含等［8］均采用顶空固相微萃取技术研究了3种不同酵母对蓝莓酒挥发性成分的影响，分别检测出29种和76种香气成分。

通常果酒的香气成分是构成和影响果酒质量、典型性的主要因素，也是评价酒品优劣的重要指标。一般来说，果酒中的香气主要来源于果实本身、发酵及陈酿3方面，而主发酵阶段则是酿酒的关键工艺所在。目前对蓝莓果实及果酒香气成分的研究已有所报道，但是对蓝莓酒主发酵前后香气成分的变化及对比尚不多见，本文采用顶空固相微萃取与气质联用技术，对蓝莓果酒主发酵前后挥发性物质进行分析，以期为蓝莓酒香气成分研究及品质评价标准提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓冻果(南高丛，产自浙江诸暨)，浙江蓝美农业有限公司;葡萄酒活性干酵母，安琪酵母股份有限公司;果胶酶(30 U/mg)，合肥博美生物科技有限责任公司;白砂糖等均为市售食品级。

1.2 仪器设备

PAL-3手持式数字折射仪，日本ATAGO公司;MJ-176NR榨汁/搅拌机，日本松下电器产业株式会社;SW-CJ-1FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;ZHWY-2102C恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司;HWS-12电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司;S22-2恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司;Agilent 7890A气相色谱仪，美国Agilent公司;Agilent 5975C质谱仪，美国 Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME 萃取头，美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 蓝莓酒发酵工艺流程［9－10］

1.3.2 固相微萃取

准确量取5 mL样品移入10 mL钳口样品瓶中，加入2.00 g NaCl，聚四氟乙烯隔垫密封，在磁力搅拌器上加热至60℃，平衡30 min后，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头顶空吸附40 min，插入GC进样口解析5 min进行GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS测定

气相色谱条件:毛细管柱为DB-WAX(30 m×320 μm ×0.25 μm)，程序升温，起始温度40 ℃，保持3 min，以3℃/min升至160℃，保持2 min，再以8℃/min升至220℃，保持3 min，进样口温度250℃。

质谱条件:MS电离方式为EI，电子能量70 eV，离子源温度230℃。

定性分析:应用气相色谱-质谱联用仪进行分析鉴定，并利用C6～C20正构烷烃的保留时间计算各个色谱峰的保留指数。分析结果运用计算机谱库(NIST05a)进行初步检索及资料分析，再结合文献进行人工谱图解析确认检测物成分。

2 结果与讨论

2.1 蓝莓酒主发酵前后挥发性成分的GC-MS分析

图1 蓝莓酒主发酵前挥发性成分的GC-MS总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of GC-MS for volatile components in blueberry wine before primary fermentation

蓝莓酒主发酵前后挥发性成分的GC-MS分析结果分别见图1、图2和表1表2。结果显示，蓝莓酒主发酵前的挥发性成分主要由萜类(11种)、醇类(12种)、酯类(8种)和酸类(3种)等共36种成分组成。主发酵后的挥发性成分较多，主要由萜类(13种)、酯类(13种)、烃类(8种)、醇类(7种)和酸类(4种)等共46种成分组成。

图2 蓝莓酒主发酵后挥发性成分的GC-MS总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of GC-MS for volatile components in blueberry wine after primary fermentation

表1 蓝莓酒主发酵前挥发性成分的GC-MS分析结果Table 1 Analytical results of GC-MS for volatile components in blueberry wine before primary fermentation

续表1

表2 蓝莓酒主发酵后挥发性成分的GC-MS分析结果Table 1 Analytical results of GC-MS for volatile components in blueberry wine after primary fermentation

续表2

2.2 蓝莓酒发酵前后挥发性成分的比较分析

由表1、表2可知，蓝莓酒主发酵前后挥发性成分的种类和构成变化较大，由36种增加到46种，新增8种烃类化合物，萜类和酯类化合物的种类有所增加，而醇类化合物则有所减少。主发酵过程是完成蓝莓酒由果汁到果酒的主要香气变化阶段，通过对其前后挥发性组分的变化研究可作为未来工艺改进和工艺控制的基础依据。

2.2.1 醇类化合物

在主发酵阶段，醇类物质主要由酵母等微生物作用于糖分、果胶质和氨基酸等转化产生，也包括亚麻酸降解产物的氧化。通过主发酵后，新增3种成分，分别为异丁醇、2，7-二甲基-4，5-辛二醇和十三醇;消失了8种成分，分别为叶醇、2-环戊基乙醇、(S)-2-庚醇、2-乙基-1-己醇、正辛醇、2-(4-甲基苯基)丙-2-醇、6-甲基-2-(2-环氧乙烷基)-5-庚烯-2-醇和月桂醇。

乙醇是蓝莓发酵酒中除水以外的主要成分，它本身几乎无味，但会增加酒的刺激感和浓郁度，决定着蓝莓果酒的基本口感。其主要来源于蓝莓汁中的糖分在无氧条件下由酵母菌代谢分解为乙醇和二氧化碳。在酒精发酵过程中，乙醇含量增加的同时总伴随着还原糖含量的下降，一般在前发酵阶段还原糖含量下降速度最快，发酵3 d以后乙醇含量快速升高，至8d左右还原糖含量的减少趋于缓慢，此时乙醇含量通常处于较高水平。整个主发酵过程是产生乙醇的关键阶段。

苯乙醇是一种具有淡雅细腻玫瑰气味的芳香醇，自然存在于许多植物的精油中，如风信子、茉莉等，它在很低的浓度下就能产生很高的玫瑰香味，是葡萄酒重要的呈香物质之一［11］。在发酵过程中，一些酵母菌能够通过莽草酸途径从头合成或通过氨基酸分解途径将L-苯丙氨酸转化为苯乙醇［12］。不过大多数酵母从头合成苯乙醇的浓度都很低，若添加L-苯丙氨酸可以大大提高苯乙醇的含量，且不同酵母发酵产生苯乙醇的能力也各不相同。

正己醇是一种具有水果清香味的重要呈味物质，在草莓［13］、苹果［14］、番石榴［15］、梨、杏子和桃［16］果实的挥发性成分中均检测含有正己醇，于爱梅等［17］还比较了苹果浓缩汁及其发酵酒中的香气物质，发现正己醇在发酵以后含量显著降低。这可能是因为正己醇在乙酸参与的条件下经醇酰基转移酶(AAT)催化生成乙酸己酯或丁酸己酯，它在脱氢酶(ADH)的还原作用下还可能转化为己醛［18］。

新出现的醇类化合物主要为异丁醇等高级醇。高级醇又称杂醇，丙醇以上即可称为高级醇，苯乙醇、正己醇等杂醇均是果酒香气的主要构成，含量适当可改善酒体的口感，但是由于人体分解高级醇比乙醇困难得多，所以容易造成麻醉，引起缺氧和头痛等症状［19］。有些酵母可以利用氨基酸中的氨经脱羧后生成高级醇，一般蛋白质含量越高，其生成的高级醇也越多。同时，这些高级醇还是一些酯类物质的前体，有利于后期陈酿香的产生。

消失的叶醇和月桂醇分别具有强烈的绿色嫩叶气味和花香味，它们的消失使蓝莓果酒中的生青味明显降低，生酒味才得以体现。

而且，整个主发酵阶段几乎没有检测出类似甘油等能够赋予果酒甜味和醇味的多元醇类化合物，这可能是因为发酵的时间较短，且厌氧条件下也不利于微生物产生多元醇。

2.2.2 酯类化合物

酯类在酒精发酵过程中是以副产物的形式出现的。酯化反应速度很慢，并且反应到一定程度即行停止，一般是在酯化酶的作用下合成的。酯化酶催化酵母细胞内的活性酸与醇结合形成酯。其中的脂肪酸乙酯类产生于发酵过程中的酶代谢以及脂肪酸代谢过程中乙酰辅酶-A的降解;乙酸酯类是由乙酰辅酶-A与氨基酸或碳水化合物降解过程中产生的高级醇反应生成。在蓝莓酒主发酵后新增11种酯类，消失6种。

酯类物质是果酒的主体香气成分，多数酯类物质都具有令人愉快的香气。其中乙酸乙酯具有果香味，是葡萄酒香气的重要构成成分［20］。王家利等［21］对红树莓果实发酵前后的香气成分变化进行研究，结果只在后发酵样品中检测到乙酸乙酯(1.15%)，在红树莓果汁及主发酵阶段均未检出;严红光等［22］也只在兔眼蓝莓发酵酒中检测到乙酸乙酯(0.47%)，而其果实中亦未检出;而张春雨等［5－6］分别在1个半高丛越橘品种‘北蓝’和4个高丛越橘品种‘蓝乐’、‘泽西’、‘埃利奥特’和‘达柔’果实中检测到少量乙酸乙酯(0.042～0.265 μg/g)。说明蓝莓发酵酒的乙酸乙酯一部分来源于果实本身，另一部分则来源于发酵阶段。所以除了适当延长陈酿时间以外，还可以通过选择含乙酸乙酯的蓝莓品种作为酿酒原料来提高果酒中乙酸乙酯的含量。

乳酸乙酯和乙酸乙酯一样具有减弱尖酸味，协调苦涩味，令酒香醇厚等作用，它们都是反映果酒风味优劣的重要物质。而蓝莓酒在主发酵阶段已经产生微量的乳酸乙酯，说明通过调整主发酵工艺也可以改变部分陈化产物的含量，改善新酒的不良口感。但是酯类的生成量与发酵强度密切相关，发酵一旦停止，酒的香气就会减弱，所以蓝莓酒主发酵过程中温度等工艺条件对乙酸乙酯及乳酸乙酯等酯类物质含量的影响尚待进一步研究。

主发酵产生甲酸异戊酯有特殊的香蕉和李子的香甜气［23］，为甲酸酯类中香味最浓的一种。凌育赵等［24］在柿子果酒香气成分的GC-MS分析中发现甲酸异戊酯相对含量高达7.44%;战宇等［25］发现菠萝、芒果和香蕉的混酿果酒中含有甲酸异戊酯(0.96%)，而在菠萝单酿果酒中尚未检出，也有在啤酒［26］和南非特有的 Pinotage 红酒［27－28］中检测出甲酸异戊酯，但是在蓝莓发酵酒中测得甲酸异戊酯含量之高尚属首次。同时还产生了具有甜香、果香及菠萝蜜气味的山梨酸乙酯，具有玫瑰花香和橙子果香的辛酸乙酯，以及能够反映出微弱的水果香、脂肪香、刺激、苦涩等香气的乳酸乙酯、癸酸乙酯和肉桂酸乙酯等［29］。

2.2.3 酸类化合物

除了少部分挥发性有机酸来源于蓝莓原料，其他酒中大部分有机酸都是发酵的副产物。在主发酵前后有机酸种类变化并不明显，其对蓝莓酒发酵香的贡献需通过进一步准确定量方可得到结论。

2.3.4 萜类化合物

萜类广泛存在于浆果类水果中，但能够称之为香气的主要是具有挥发性的游离型单萜和倍半萜，而且萜类的沸点相对较高，香气更加沉稳。在所检出的19种萜类化合物中，有6种物质在发酵后消失，为α-葑烯、二氢香芹酮、脱氢芳樟醇、α，4-二甲基-3-环己烯-1-乙醛、橙花醇和薄荷醇，有8种物质在发酵中所产生，为伪柠檬烯、异松油烯、α-紫罗兰酮、芳樟醇氧化物(II)等。其中芳樟醇属于链状萜烯醇类［30］，是存在于欧洲越橘(Vaccinium myrtillus)中的重要萜类化合物［31］;而香芹酮及α-松油醇等都属于单环单萜类。蓝莓酒中的萜类化合物与蓝莓的品种密切相关，在高丛越橘的果实发育过程中萜类是其特征香气成分之一，而在半高丛越橘中所占比例十分有限［32］。在蓝莓发酵前测得主要的萜类包括有:芳樟醇具有优美的花香香气，α-松油醇具有紫丁香的香气，橙花醇具有令人愉快的玫瑰和橙花的香气，香气较平和，微带柠檬样的果香，香叶醇具有温和香甜的玫瑰花气息，香茅醇具有优雅的类似于玫瑰花的香气，D-柠烯具有令人愉快的柠檬香气。

2.3.5 烃类及其他化合物

烃类化合物主要产生于发酵过程中糖代谢和各级物质的分解，它们是其他物质的代谢中间产物，大多为不饱和烯烃类物质。在所检出的8种烃类化合物中，除 2，4-己二烯、3-甲基-1-环己烯、1-甲基-1-环己烯、(E)-2，3-二甲基-2，4-己二烯和 1-甲基环庚烯以外其余3种均为具有苯环结构的芳香烃类，且这8种物质均为发酵后产生。还有2种其他类化合物，其中苯甲醛是具有苦杏仁味的结构最简单的芳香醛，也是浸泡青梅酒的特征香气物质之一［33］，但在发酵后消失而未被检出;而2-乙氧基苯酚在其他有关蓝莓及蓝莓酒的文献中尚未见报道。

3 结论

采用固相微萃取(SPME)结合气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术，分别对蓝莓酒主发酵前、后的挥发性成分进行测定。结果显示，蓝莓酒主发酵前后挥发性成分的种类和构成变化较大，由36种增至46种，分属于醇类、酯类、萜类、酸类和烃类，表明主发酵过程是完成蓝莓酒由果汁到果酒的主要香气变化阶段。通过对其前后挥发性组分的变化研究，以期为蓝莓酒香气成分研究及品质评价标准提供科学依据。

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