力达霉素诱导人多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞凋亡和周期阻滞

李开济，魏静波，骆广玲，赵毓芳，闫 丰，吕翠平，甄永占*

(1.河北联合大学 基础医学院 组织学与胚胎学教研室，河北 唐山063000;2.开滦医疗集团林西医院 妇产科，河北 唐山063000;3.河北联合大学 附属医院 肿瘤科，河北 唐山063000)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是血液系统第2 大常见恶性肿瘤，目前多发性骨髓瘤仍然不可治愈。在硼替佐米(bortezomid)等新药出现之前，多发性骨髓瘤患者中位生存期仅3年。但硼替佐米不能根治多发性骨髓瘤，且随着其临床应用范围的扩大和时间的推移，部分患者对硼替佐米产生了耐药反应，因此人们积极寻找新的抗多发性骨髓瘤药物以进一步提高多发性骨髓瘤患者的生存率和治愈率[1-2]。力达霉素(lidamycin，LDM)是大分子肽类抗肿瘤抗生素，大量研究[3-7]表明:LDM 具有较强的抗肿瘤活性，但这方面的研究主要为LDM 抗实体瘤的研究，本研究探讨了LDM 抗多发性骨髓瘤的作用，为今后在LDM 多发性骨髓治疗中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂

鼠骨髓瘤细胞RPMI 8226(河北联合大学基础医学院平台实验室传代保存)。用含10%胎牛血清(Hyclone)的RPMI1640 培养液(Gibco 公司)，于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，2 d 传代1次，实验用细胞为对数生长增殖期细胞。主要试剂:LDM(中国医学科学院医药生物技术研究所甄永苏院士惠赠)。蛋白定量试剂盒(BCATMprotein assay kit)(Pierce 公司)，宽范围蛋白预染Marker(New England Biolabs 公司)，蛋白质印迹发光液和PVDF膜(Millipore 公司)，Actin 抗体(sc-1616)(Santa Cruz 公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔、兔抗羊和羊抗小鼠IgG 抗体(北京中杉金桥有限责任公司)，凋亡相关分子抗体试剂盒、细胞周期相关分子抗体试剂盒(Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 MTS法检测细胞存活率

MTS[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt]是MTT的一种新型类似物，化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2-磺)-5-(3-羧甲基氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2 氢四唑内盐。原理是MTS 在 吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)存在的情况下可被活细胞内的脱氢酶类还原，转化成液态可溶的产物，而死细胞无此功能，该水溶物可用酶标仪在波长490 nm 处检测，测定在490 nm 波长处的光吸收(A)值，该值可间接反应活细胞的数量和活性。取对数增长期的RPMI 8226细胞，轻轻吹打分散成细胞悬液，记数后细胞以1×104个/孔接种细胞于96 孔细胞培养板中，2 h后随机分为对照组、0.1、0.5 和1 nmol/L LDM组，药物处理48 h，每组至少3个平行孔。每孔加入20 μL MTS 和PMS 混合液(按说明书配制:每2 mL MTS 溶液中加入100 μL PMS，现用现配)，37℃继续培养1～4 h，用酶标仪于490 nm 处测定每个孔A490值。实验设无药对照孔和无细胞对照孔各3 孔，按下面公式计算细胞的存活率:细胞存活率= (加药组A490值-空白组A490值)/(对照组A490值-空白组A490值)×100%。实验重复3次。

1.3 Annexin V-FITC/PI 法分析细胞凋亡

细胞经药物处理后，收集细胞，并用冰冷的PBS洗涤，将待测细胞数调整为(5～10)×108/L，取1 mL细胞于4℃、1 000 r/min 离心10 min，弃上清液，PBS 洗涤，将细胞重悬于结合缓冲液300 μL，加入Annexin V/FITC 10 μL，轻轻摇匀，室温反应1 h，加入PI 5 μL 轻轻摇匀，室温反应15 min，细胞经200 目尼龙网过滤后，在流式细胞检测仪上进行检测，结果以凋亡率表示。

1.4 流式细胞术检测细胞周期分布

细胞经药物处理后，收集细胞，加入冰冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)将细胞轻轻吹打成单个细胞，离心，PBS 洗2遍，用约500 μL PBS 重悬细胞，一边振荡一边加入5 mL 预冷的70%乙醇，4℃固定过夜(如不及时测定，可放-20℃保存2 周)。染色前细胞用PBS 洗2遍，沉淀重悬于PI 染液中(50 μg/mL PI+200 μg/mL RNase A)，37℃避光染色30 min。细胞经200 目尼龙网过滤后，采用流式细胞术测定DNA 含量并分析细胞周期变化，结果以各个细胞周期所占的百分率表示。

1.5 蛋白质提取和Western blot检测

收集不同药物作用48 h 及未加药处理的RPMI 8226细胞，用预冷的1×PBS 洗3遍，加入新鲜配制的细胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5;1%NP-40;150 mmol/L NaCl;1 mmol/L Na3VO4;1 mmol/L NaF，临用时加入3种蛋白酶抑制剂:1%抑蛋白酶肽、10 g/L 亮抑酶肽、1 mmol/L 苯甲基磺酰氟)100 μL，细胞与裂解液充分混合，冰浴20 min。于4℃、13 000 r/min 离心15 min，收集上清液于新的微量离心管中，采用BCA法测定蛋白含量。取各样品等量总蛋白30 μg 加入0.25倍体积的5×上样缓冲液，煮沸变性5 min后，在10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)胶上进行电泳。然后转移到硝酸纤维素膜上，1% BSA封闭1 h，一抗4℃孵育过夜后，加相应二抗孵育2 h，膜上滴加化学发光增强剂(santa Cruz biotechnology SC-2048)，按照试剂说明进行操作，结果在凝胶成像仪上照相并使用Bio-Rad 公司Quantity One分析软件测量条带灰度值，目的条带与β-actin条带灰度值比值即为该目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学分析

采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析，各组A值和细胞凋亡率以均值±标准查(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 各组细胞存活率

LDM 呈浓度依赖性抑制RPMI 8226细胞增殖，随着LDM浓度的增高，各浓度LDM组RPMI 8226细胞存活率较对照组逐渐降低(P＜0.05)(表1)。

表1 各组细胞存活率Table1 Proliferation rate of RPMI 8226 cells in various groups(n=3，%，±s)

表1 各组细胞存活率Table1 Proliferation rate of RPMI 8226 cells in various groups(n=3，%，±s)

＊P＜0.05 compared with control group.

group cell proliferation rate control 100 0 LDM 0.1 nmol/L 83.3 4.1*LDM 0.5 nmol/L 77.5 4.3*LDM 1 nmol/L 71.9 3.7*

2.2 各组细胞凋亡率

0.1、0.5和1 nmol/L LDM 作用48 h后，RPMI 8226细胞凋亡率分别为11.3%±1.2%、20.5%±1.9%和44.9%±2.5%，显著高于对照组的4.1%±0.6%(P＜0.05)(图1)。

图1 各组细胞凋亡率Fig1 Apoptosis rate of RPMI 8226 cells in various groups

2.3 各组细胞周期分布

RPMI 8226细胞给药48 h后，0.1 和0.5 nmol/L LDM组细胞S期和G2/M期阻滞(P＜0.05)。而1 nmol/L LDM组细胞S期阻滞，显著高于对照组(P＜0.05)(图2，表2)。

2.4 各组细胞凋亡相关蛋白的表达量

0.1、0.5和1 nmol/L LDM 作用RPMI 8226细胞48 h后，caspase-9、caspase-3、caspase-7 和PARP的蛋白被切割显著高于对照组(P＜0.05)(图3，表3)。

图2 各组细胞周期分布Fig2 Cell cycle distribution of RPMI 8226 cells in various groups

表2 各组细胞周期分布Table2 Cell cycle distribution of RPMI 8226 cells in various groups(n=3，%，±s)

表2 各组细胞周期分布Table2 Cell cycle distribution of RPMI 8226 cells in various groups(n=3，%，±s)

*P＜0.05 compared with control group.

groups G1 S G2/M control 25.55±3.15 48.76±3.51 25.65±2.13 LDM 0.1 nmol/L 1.43±0.62* 54.36±5.63* 43.66±2.63*LDM 0.5 nmol/L 2.53±0.57* 55.64±5.37* 41.83±2.44*LDM 1 nmol/L 1.61±0.54* 80.15±6.32*18.21±1.71

图3 Western blot 分析RPMI 8226细胞凋亡相关蛋白的表达水平Fig3 Expression levels of proteins associated with apoptosis in RPMI 8226 cells detected by Western blot

表3 各组细胞凋亡相关蛋白的表达水平Table3 The cleaved fragment levels of caspase-9，caspase-3，caspase-7 and PARP(±s，%，n=3)

表3 各组细胞凋亡相关蛋白的表达水平Table3 The cleaved fragment levels of caspase-9，caspase-3，caspase-7 and PARP(±s，%，n=3)

＊P＜0.05 compared with control group.

group CF-caspase-9 CF-caspase-3 CF-caspase-7 CF-PARP control 100±5 100±10 100±8 100±7 LDM 0.1 nmol/L 94±5 315±13* 150±9* 153±9*LDM 0.5 nmol/L 228±16* 313±13* 243±8* 348±16*LDM 1 nmol/L 231±17* 326±13* 256±13* 360±19*

2.5 各组细胞周期相关蛋白的表达量

0.1、0.5和1 nmol/L LDM 作用RPMI 8226细胞48 h后，P21 和P27 蛋白表达量显著高于对照组(P＜0.05)(图4，表4)。

图4 Western blot检测各组RPMI 8226细胞内周期相关蛋白的表达量Fig4 Expression levels of proteins associated with ERS in RPMI 8226 cells detected by Western blot method in various groups

表4 各组细胞周期相关蛋白的表达水平Table4 Expression levels of P21 and P27(n=3，%，±s)

表4 各组细胞周期相关蛋白的表达水平Table4 Expression levels of P21 and P27(n=3，%，±s)

＊P＜0.05 compared with control group.

group P21 P27 control 100±4 100±4 LDM 0.1 nmol/L 297±7* 188±10*LDM 0.5 nmol/L 330±7* 193±4*LDM 1 nmol/L 360±8*320±8*

3 讨论

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是血液系统第2 大常见恶性肿瘤，尽管对多发性骨髓瘤的生物学研究取得了长足进展，对于绝大多数患者来说其仍然是一种难以治愈的致死性疾病，因此人们积极寻找新的抗多发性骨髓瘤药物以进一步提高多发性骨髓瘤患者的生存率和治愈率[1-2]。

LDM 属于烯二炔类抗生素，可诱导DNA 单、双链的断裂。大量研究[3-7]表明:LDM 具有较强的抗实体瘤活性。本研究发现LDM 能够抑制人多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞的增殖，并诱导其发生凋亡，流式细胞术检测结果显示LDM 0.1、0.5 和1 nmol/L作用48 h 可使RPMI 8226细胞出现凋亡，而且细胞凋亡率与药物的浓度有明显的关联。0.1和0.5 nmol/L LDM 使RPMI 8226细胞G2/M期阻滞，1 nmol/L LDM 引起S期阻滞。

细胞发生凋亡的过程中，caspase 家族蛋白酶在凋亡信号传导中起着关键性的作用，caspase 在细胞中最初是以前体形式存在的。当起始caspase 通过形成寡聚体被激活后，就可以切割效应caspase。激活的效应caspase 反过来又可以切割一系列特异的细胞底物，caspase的最主要的底物是PARP。结果使受PARP 负调控影响的核酸内切酶的活性增高，裂解核小体间的DNA，引起细胞凋亡。本研究发现:LDM 作用后RPMI 8226细胞caspase-3、caspase-7、caspase-9 和PARP的切割片段蛋白表达量。因此可以推断LDM 能够通过线粒体途径诱导RPMI 8226细胞凋亡。

P21 和P27 属于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(CDKI)已证明一些CDKI是潜在的肿瘤抑制因子或抑癌基因，P21 可与增殖细胞系抗原PCNA结合抑制DNA 复制，促进DNA 损伤修复，确保遗传信息的稳定性和准确性，对肿瘤有抑制作用。P27基因及其产物对于细胞有极其重要的调控作用，在某些肿瘤组织和肿瘤细胞系发现P27表达异常并与肿瘤的发生发展复发密切相关[8-9]。

本研究也显示，LDM 在增加P21蛋白水平的同时也增加P27 蛋白表达水平。提示LDM 能够通过P21 和P27 信号通路发挥抗肿瘤作用。

综上所述，LDM 能够抑制多发性骨髓瘤细胞RPMI 8226细胞增殖，通过线粒体途径诱导RPMI 8226细胞凋亡，并能诱导多发性骨髓瘤细胞S期和G2/M期阻滞，但其具体作用途径和分子机制尚需进一步研究。

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