GSK-3β过表达促进人胶质瘤细胞增殖及侵袭

石 歆

(河南中医学院 第一附属医院 内科，河南 郑州450000)

胶质瘤是常见中枢神经细胞原发性肿瘤，具有较高的发病率和致死率。糖原合酶激酶-3(Glycogen Synthase Kinase-3β，GSK-3β)有GSK-3α 和GSK-3β 两种亚型，其功能失调与糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病等多种疾病的病理进程息息相关[1-3]。GSK-3β是GSK-3 研究较多的亚型，越来越多的研究表明，GSK-3β 与多种肿瘤的发生发展有关[4-5]。如GSK-3β 在乳腺癌中异常活化，抑制其表达后乳腺癌细胞的增殖力明显下降，同时细胞凋亡率增加[4]。但是，GSK-3β 在胶质瘤发展中的作用尚不清楚。因此，本研究体外分析GSK-3β 在胶质瘤细胞中的表达水平，同时探讨GSK-3β对胶质瘤细胞增殖及侵袭的影响及作用机制，从而为进一步明确GSK-3β 在胶质瘤发生发展中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系:正常人星形胶质细胞1800(Sciencell 公司);人恶性胶质瘤细胞A172、T98G、U87 和U251(ATCC 公司)。

1.1.2 试剂:新生牛血清(华美生物工程有限公司);RPMI 1640 培养基(Hyclone 公司);DMEM 培养基、Trizol 和cDNA 合成试剂盒(Invitrogen 公司);噻唑蓝(MTT)(北京索莱宝科技有限公司);Lipofectamine 2000(Sigma 公司);抗人GSK-3β、PAX3 及Ki67的抗体(Cell Signaling Technology);实时荧光定量PCR 试剂盒(TaKaRa 公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养:将正常人星形胶质细胞1800和T98 胶质瘤细胞置于RPMI 1640 培养液中，3～4 d换一次液。人胶质瘤细胞A172、U87 和U251 细胞培养于DMEM 培养基中，所有细胞均置于37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 GSK-3β 重组表达载体的构建:根据已知人GSK-3β 序列设计相应表达引物，具体为:上游，5'-G CGAATTCCGAAGAGAGTGATCATGTCAG-3'，含EcoRⅠ酶切位点(斜体);下游，5'-CGCTCGAGGGCTGCTC GGGACTGTTCAGG-3'，含XhoⅠ酶切位点(斜体)。以本实验室前期合成的人一链cDNA 为模板进行PCR扩增，将扩增产物酶切后连接到酶切好的pcDNA3.1(+)载体上，构建重组表达载体pcDNA3.1(+)-GSK-3β(rGSK-3β)。将构建的GSK-3β 重组载体经LipofectamineTM2000 转染人U87 胶质瘤细胞，设置载体对照组(vector)和未处理组。

1.2.3 PAX3 siRNA转染:将U87 细胞接种于12 孔培养板中，待细胞增殖达到70%～80%汇合时，用无血清DMEM 稀释细胞。将制备的100 nmol/L siRNA-脂质体复合物采用LipofetamineTM2000 转染细胞，48 h后收集细胞，进行转染效果评估。本实验设置空白对照组、scramble siRNA(NC)组和PAX3 siRNA转染组。PAX3 siRNA 序列为:上游，5'-CGC AUCCUGAGAAGUAAAUdTdT-3';下游，5'-AUUUAC UUCUCAGGAUGCGdTdT-3';scramble siRNA 序列为:上游，5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3';下游，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。所 用 序列均由上海生工合成。

1.2.4 RNA的提取和cDNA 合成:Trizol 提取上述处理细胞的总RAN，一链cDNA 合成按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 操作说明书进行。

1.2.5 实时定量RT-PCR:GSK-3β 引物序列为(上游5'-AGTGGTGAGAAGAAAGATGAG-3';下游，3'-TGACATAAATCACAGGGAG-5');PAX3的引物序列为(上游，5'-CCGACTTGGAGAGGAAGGA-3';下游，5'-CATCTGATTGGGGTGCTGA-3')。具体按操作SYBR 荧光定量PCR 试剂盒进行操作。

1.2.6 Western blot 分析:采用细胞裂解液裂解不同处理组细胞，BCA 试剂盒分析蛋白浓度。加入约25 μg 蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳，半干转法将目标蛋白转移至NC 膜上。加入5%脱脂奶粉，4℃过夜;TBST 洗涤后分别加入抗人GSK-3β、PAX3 一抗和HRP 标记的二抗。用ECL 显影，β-actin 为内参。

1.2.7 MTT 测细胞增殖:按2×104个/孔将细胞接种于96孔板中，各组处理方法如前。待培养板重复吸收上清后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，4 h后加入150 μL DMSO。低速振荡10 min 使结晶物充分溶解，将样品置于酶标仪上测定490 nm 处A值。

1.2.8 Transwell 分析细胞的侵袭能力:将Transwell小室用预热的无血清培养基处理15～30 min;取200 μL 不同处理组无血清细胞悬液接种于上腔室，下室加入700 μL 含10%胎牛血清的DMEM，室温下培养24 h。取Transwell 膜，洗涤2次后用4%多聚甲醛固定25 min，HE染色后显微镜下随机选取9个视野进行观察，统计穿膜细胞数。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 GSK-3β 在胶质瘤细胞中高表达

与正常人星形胶质细胞1800 相比，4种人胶质瘤细胞中GSK-3βmRNA 水平明显增高，且GSK-3β在U87 中的mRNA 水平约是1800 细胞的3.64倍(P＜0.05)(图1A)。此外，与1800 细胞相比，上述4种人胶质瘤细胞中GSK-3β的表达水平明显增加(图1B)。

图1 GSK-3β 在胶质瘤细胞中的表达水平Fig1 The expression levels of GSK-3β in glioma cells

2.2 rGSK-3β转染效果

rGSK-3β转染后胶质瘤细胞中rGSK-3β的蛋白水平明显高于对照组(图2A)，约是对照组的3.45倍(P＜0.05)(图2B)。

图2 rGSK-3β转染效果评估Fig2 Effect of rGSK-3β transfection

2.3 GSK-3β对胶质瘤细胞增殖的影响

与对照组和空载体处理组相比，GSK-3β过表达后细胞的存活率明显增加(图3A)(P＜0.05)，同时细胞增殖标记分子Ki67 蛋白明显增加(图3B)(P＜0.05)。

2.4 GSK-3β对胶质瘤细胞侵袭的影响

GSK-3β过表达后侵出小室的细胞数目明显高于对照组和载体处理组(P＜0.05)(图4)。

2.5 GSK-3β对胶质瘤细胞中PAX3表达水平的影响

GSK-3β过表达后U87 细胞中PAX3的mRNA水平明显增高，约是对照组的3.2倍(P＜0.05)(图5A);同时伴随有PAX3 蛋白水平的上调(图5B)(P＜0.05)。

2.6 PAX3 在GSK-3β 介导的细胞增殖及侵袭中的作用

与control 和NC组相比，PAX3 siRNA转染明显U87 细胞中PAX3的蛋白水平(图6A 和6B)(P＜0.05)。同时GSK-3β过表达诱导的细胞存活率(图6C)和侵袭细胞的数目明显降低明显下降(图6D)(P＜0.05)。

图3 GSK-3β对U87 细胞增殖的影响Fig3 Effect of GSK-3β on cell proliferation

图4 GSK-3β对U87 细胞侵袭能力的影响Fig4 Effect of GSK-3β on cell invasion

图5 GSK-3β对细胞中PAX3表达水平的影响Fig5 Effect of GSK-3β on PAX3 expression

图6 PAX3 在GSK-3β 介导的细胞增殖及侵袭中的作用Fig6 Function of PAX3 on GSK-3β-induced cell proliferation and invasion

3 讨论

近年来，越来越多研究证明，GSK-3β 不仅参与糖尿病、炎性反应及阿尔茨海默病等疾病的进程，还与多种肿瘤的发生发展密切相关[6-7]。但是，GSK-3β 在胶质瘤中的作用及其机制尚不清楚。本研究证实，与正常人星形胶质细胞1800 相比，人胶质瘤细胞A172、T98、U87 和U251 细胞中GSK-3β的表达明显增高，提示GSK-3β 在胶质瘤发生发展中起重要作用。

已知胶质瘤细胞的增殖及侵袭在胶质瘤的恶性进程中起关键作用，是影响患者预后和存活的关键。目前为止，对GSK-3β 在肿瘤发展中的作用有两种截然不同的观点，有研究表明，GSK-3β 具有促进肿瘤细胞增殖、转移及肿瘤发展进程的作用[6，8];也有研究证实GSK-3β 具有抗肿瘤发生发展的潜在作用[9]。为进一步分析GSK-3β 在胶质瘤中的功能，成功构建了GSK-3β过表达细胞模型。GSK-3β过表达后胶质瘤细胞增殖能力明显增加，同时伴随有侵袭细胞数目的增加，表明GSK-3β 具有促胶质瘤细胞增殖及侵袭的潜能。

PAX3是已知的调控神经元发育的关键转录因子，近年来发现其在多种肿瘤组织中高表达，与黑素瘤、横纹肌肉瘤、成神经细胞瘤等肿瘤的发展息息相关[6，10]。近期研究表明，PAX3 在胶质瘤中表达水平较高，与胶质瘤细胞的增殖、侵袭及肿瘤发生有关[11]。此外，GSK-3 能够上调PAX3的水平，从而有利于人黑素瘤细胞的存活及生长[6]。本研究证实，GSK-3β过表达促进胶质瘤细胞中PAX3的水平。进一步分析发现，PAX3 沉默后GSK-3β过表达诱导的细胞的增殖能力明显下降，同时侵袭细胞的数目降低，提示GSK-3β 可能通过调控PAX3 来影响胶质瘤细胞的增殖及侵袭进程。

综述所述，本研究证实了GSK-3β 在胶质瘤细胞中的作用及其分子机制。因此，本研究将为新型抗胶质瘤药物的研制提供新的研究方向。

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