肾透明细胞癌N-WASP蛋白表达特点及与临床病理相关性

陈 健，纪志刚*，刘广华，周 立

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院1.泌尿外科;2.基本外科，北京100730)

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，CCRCC)是肾脏恶性肿瘤最常见的病理类型，发病率在不断升高[1]，约占肾脏恶性肿瘤75%[2]。目前尚未发现能有效反应CCRCC 远处转移及预后的肿瘤指标。肿瘤的TNM分期仍为反应该疾病预后的最重要的指标。

N-WASP(neural Wiskott-Aldrich syndrome protein)蛋白对细胞肌动蛋白的聚集和细胞肌动蛋白骨架的重构起着重要作用。有研究发现N-WASP的表达与乳腺癌及结肠癌细胞局部浸润及远处转移有相关性[3-6]。但目前尚无对N-WASP 在CCRCC中的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

2006年8月至2008年11月73例肾癌患者于北京协和医院泌尿外科行根治性肾切除术或肾部分切除术。术后病理诊断为CCRCC。临床病理资料详见表1。

肿瘤组织分级参照WHO 肿瘤分级标准[7]。TNM分期参照国际抗癌联盟TNM分期第五版标准[8]。临床分期参照美国癌症联合委员会AJCC 第七版标准[8]。该实验均经患者知情同意，并由北京协和医院伦理委员会批准。

表1 肾透明细胞癌患者临床病理学指标Table1 Clinicopathological features of patients with CCRCC

1.2 方法

1.2.1 组织芯片构建:73例患者手术切除标本制成肾癌组织与癌旁正常肾组织的组织芯片。

1.2.2 免疫组织化学染色:兔抗人N-WASP 多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology 公司)及两步染色法试剂盒(EnVisionTM+kit，Dako 公司)对组织芯片行N-WASP 免疫组化染色。将4 μm 厚度组织芯片加热后置于二甲苯溶液中脱蜡，并依次置入梯度浓度乙醇溶液中水化。将10 mmol/L 枸橼酸钠缓冲溶液(pH 6.0)加热至100℃，放入组织芯片加热10～15 min进行抗原热修复。后加入3% H2O2溶液，室温反应10 min 以灭活内源性过氧化物酶。再将组织芯片加入一抗，稀释浓度为1∶50，置于48℃水浴箱中孵育过夜。经PBS 洗片后加入二抗，于37℃水浴箱中孵育30～60 min。使用二甲联苯胺(DAB)对N-WASP显色。阴性对照使用相同浓度非免疫兔血清作为一抗。免疫组化细胞质染色为阳性细胞。细胞染色强度评判依据为:0级，阳性染色细胞总数＜10%;1级，阳性染色细胞总数10%～50%;2级，阳性染色细胞总数＞50%[9]。0级、1级、2级分别对应N-WASP 弱、中、强表达。

1.2.3 随访:完整随访43例患者，随访时间为2至74个月，中位随访时间53个月。

1.3 统计学分析

McNemar 和Mann-Whitney U 检验肾癌组织与癌旁正常肾组织中N-WASP表达差异。卡方检验分析肾癌组织N-WASP表达与患者临床病理资料的相关性。Kaplan-Meier 方法评估患者总体生存率，并使用log-rank 检验分析生存曲线。Cox 比例风险回归模型进行单因素及多因素预后分析。使用SPSS 13.0 软件包进行统计分析。

2 结果

癌旁正常肾组织N-WASP 染色强，并主要表达于细胞质及细胞核;而癌组织N-WASP表达弱，主要表达于细胞核(图1)。正常肾组织N-WASP 染色强于癌组织(P＜0.001)(表2)。CCRCC 病理分级与癌组织N-WASP表达水平具有显著相关性(P＜0.05)。随访43例患者中，27 人癌组织N-WASP 呈弱、中度表达，其中4 人因肾癌死亡。16 人癌组织N-WASP 强表达，其中10 人死于肾癌。癌组织NWASP表达呈弱、中度表达的患者生存率高于呈强表达的患者(P＜0.01)。单因素预后分析显示，癌组织N-WASP表达水平(P＜0.01)，患者手术时年龄(P＜0.05)及肾癌病理级别(P＜0.05)与患者总体预后有关(表3)。多因素预后分析显示，肾癌组织N-WASP表达水平可以作为预测CCRCC 预后的独立预测因素(P＜0.05)(表4)。

图1 N-WASP 在肾透明细胞癌及癌旁正常肾组织中的表达Fig1 N-WASP expression in normal renal tissues and CCRCC(×200)

表2 癌组织及癌旁肾组织N-WASP表达水平Table2 Expression profiling of N-WASP in CCRCC and normal renal tissue

表4 肾透明细胞癌患者生存相关多因素分析Table4 COX multivariate analysis of clinicopathological parameters and overall survival

3 讨论

WASP蛋白(Wiskott-Aldrich syndrome protein)在1994年首次发现[2]。1996年，一种与WASP 有近50%的相似度的新蛋白被纯化。由于在哺乳动物神经组织内表达水平最高，因此被命名为neural-WASP(N-WASP)[3，10]。WASP 与N-WASP 结 合 并激活Arp2/3 复合物，使肌动蛋白由单体形式聚合成肌动蛋白丝多聚体，参与细胞肌动蛋白骨架的重构，改变细胞的形态及活动力[4]。恶性肿瘤细胞远处转移过程包括:局部扩增，从原发灶脱落，穿透基底膜屏障，迁入并迁出血管，在转移灶生长。整个过程均由肿瘤细胞形态改变和运动能力介导。N-WASP在调节细胞形态及运动能力中发挥重要作用[5]。尽管N-WASP 在恶性肿瘤局部浸润及远处转移中起着重要作用，但其表达特点在不同恶性肿瘤中却不尽相同。

对乳腺癌细胞的研究显示，敲除N-WASP的活性片段，使得MTLn3 乳腺癌细胞失去N-WASP的活性[11]，肿瘤细胞远处转移能力下降。而另有研究显示，N-WASP 在乳腺癌组织中的表达明显下调，特别是在恶性程度高，或淋巴结阳性等预后较差的病例中，表达下调尤为明显[12]。将MDA-MB-231 侵袭性乳腺癌细胞系N-WASP 过表达，可使细胞活动度和侵袭能力下降。食管癌组织中N-WASP表达水平升高，然而并未发现N-WASP表达水平与患者的总体预后存在相关性[13]。肝细胞癌的研究也提示，肝细胞癌中N-WASP表达上调，且能提示患者预后[14]。

该研究发现N-WASP表达在CCRCC 中明显下降。但是，N-WASP 在CCRCC 中的表达与肿瘤病理分级相关。这说明在不同肿瘤中N-WASP的表达存在组织特异性，提示其在肿瘤发生中起不同作用。另外，N-WASP的表达并不是固定的:N-WASP 在正常肾组织中高表达，而在早期CCRCC 中有降调节，随着肿瘤进展再次升高。这提示N-WASP的表达存在时间特异性。

有趣的是，另一肿瘤标志物在CCRCC 中也有着相似的表达模式。ZBP-89 蛋白在肾透明细胞癌中的表达也低于正常肾组织[15]。ZBP-89 在肿瘤组织中的表达与肿瘤TNM分期和远处转移存在相关性:肿瘤组织中ZBP-89 高表达提示患者预后不良。单因素和多因素分析也发现ZBP-89是总体生存率的潜在预后因素。

N-WASP 在CCRCC 中的表达下降。肿瘤组织中该蛋白表达水平与病理分级相关。肿瘤中N-WASP高水平表达提示CCRCC患者预后不良。N-WASP表达水平可以作为预测CCRCC 预后的独立预测因素。N-WASP 对CCRCC 发展方面的作用机制，还需要更进一步的研究阐明。

[1]Qin C，Sun LJ，Cui L，et al.Application of the revised Tumour Node Metastasis (TNM)staging system of clear cell renal cell carcinoma in eastern China:advantages and limitations[J].Asian J Androl，2013，15:550-557.

[2]Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2008，58:71-96.

[3]Derry JM，Ochs HD，Francke U.Isolation of a novel gene mutated in Wiskott-Aldrich syndrome[J].Cell，1994，78:635-644.

[4]Kowalski JR，Egile C，Gil S，et al.Cortactin regulates cell migration through activation of N-WASP[J].J Cell Sci，2005，118;79-87.

[5]Parsons M，Monypenny J，Ameer-Beg SM，et al.Spatially distinct binding of Cdc42 to PAK1 and N-WASP in breast carcinoma cells[J].Mol Cell Biol，2005，25:1680-1695.

[6]Oser M，Mader CC，Gil-Henn H，et al.Specific tyrosine phosphorylation sites on cortactin regulate Nck1-dependent actin polymerization in invadopodia[J].Cell Sci，2010，123:3662-3673.

[7]Eple JN，Sauter G，Epstein JI，et al.Pathology and genetics:tumours of the urinary system and male genital organs[M].Lyon:IARC Press，2004:125.

[8]Edge SE，Byrd DR，Compton CC，et al.AJCC Cancer staging manual[M].New York:Springer NY，2009:41.

[9]Zhang H，Liu J，Cagle PT，et al.Distinction of pulmonary small cell carcinoma from poorly differentiated squamous cell carcinoma:an immunohistochemical approach[J].Mod Pathol，2005，18:111-118.

[10]Miki H，Takenawa T.Regulation of actin dynamics by WASP family proteins[J].J.Biochem，2003，134:309-313.

[11]Gligorijevic B，Wyckoff J，Yamaguchi H，et al.N-WASPmediated invadopodium formation is involved in intravasation and lung metastasis of mammary tumors[J].J Cell Sci，2005，125:724-734.

[12]Martin TA，Pereira G，Watkins G，et al.N-WASP is a putative tumour suppressor in breast cancer cells，in vitro and in vivo，and is associated with clinical outcome in patients with breast cancer[J].Clin Exp Metastasis，2008，25:97-108.

[13]Wang WS，Zhong HJ，Xiao DW，et al.The expression of CFL1 and N-WASP in esophageal squamous cell carcinoma and its correlation with clinicopathological features[J].Dis Esophagus，2010，23:512-521.

[14]Jin KM，Lu M，Liu FF，et al.N-WASP is highly expressed in hepatocellular carcinoma and associated with poor prognosis[J].Surgery，2013，153:518-525.

[15]Cai MY，Luo RZ，Li YH，et al.High-expression of ZBP-89 correlates with distal metastasis and poor prognosis of patients in clear cell renal cell carcinoma[J].Biochem Biophys Res Commun，2012，426:636-642.